劉佳月，郭樹娟，鄭昊元，趙惠賢,2，劉香利,2

(1.西北農(nóng)林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境分子生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

小麥(L.)是世界上廣泛種植的重要糧食作物之一，干旱、高溫和鹽堿是導致小麥減產(chǎn)的主要非生物脅迫。因此，小麥逆境脅迫響應基因的功能研究對于小麥抗逆遺傳改良具有重要意義。14-3-3蛋白是在牛腦中發(fā)現(xiàn)的酸性可溶性蛋白，根據(jù)其經(jīng)二乙氨乙基纖維素柱層析后的分離組分及其在凝膠電泳中的遷移率而命名。目前編碼14-3-3蛋白的基因已經(jīng)在擬南芥()、水稻()、二穗短柄草()等物種中被分離并鑒定出來。14-3-3蛋白在真核生物中廣泛存在且高度保守，可通過同源或異源二聚體結(jié)合多種靶蛋白(如代謝相關(guān)的酶)、轉(zhuǎn)錄因子(如ABF、CBF和MYB)、蛋白激酶(如CDPK和CRPK1)以及磷酸酶(如MAPK磷酸酶)等，參與植物代謝、發(fā)育以及脅迫響應等多種生理過程和信號途徑。

植物響應鹽脅迫主要通過鹽超敏感(salt overly sensitive，SOS)信號轉(zhuǎn)導途徑。研究表明，擬南芥14-3-3蛋白λ和k可與SOS2蛋白互作，抑制其激酶活性，從而負調(diào)節(jié)鹽脅迫的耐受性；在煙草中過表達二穗短柄草14-3-3蛋白基因和小麥14-3-3蛋白基因后，轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性均增強。小麥14-3-3蛋白家族成員TaGRF6-A通過與MYB轉(zhuǎn)錄因子TaMYB64相互作用，也可正向調(diào)控鹽脅迫的耐受性。

本課題組前期對小麥14-3-3蛋白基因家族進行了鑒定，并對其非生物逆境脅迫下的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)位于小麥3D染色體上的基因在小麥非生物逆境脅迫下上調(diào)表達。因此，本研究對基因進行克隆，并利用過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥對基因在鹽脅迫下的功能進行初步分析，以期為小麥14-3-3蛋白基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

試驗所用的小麥材料為中國春，擬南芥材料為哥倫比亞野生型(Columbia-0)，均由本試驗室保存。

1.1.2 載體與菌株

基因克隆載體pMD19T為TaKaRa產(chǎn)品，植物表達載體為經(jīng)本試驗室改造的pCAMBIA1304(植物中抗性替換為Basta除草劑抗性，35S啟動子序列后引入酶切位點Ⅰ和Ⅲ)，大腸桿菌菌株DH5α 和農(nóng)桿菌菌株GV3101均由本試驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1 小麥基因的克隆

根據(jù)NCBI中基因的序列(TraesCS3D01G055500)，利用Primer Premier 5.0設計特異引物TaGF14m-F/R(表1)，用CTAB法提取小麥幼苗葉片的基因組DNA。利用RNA提取試劑盒(BioTeke，北京)提取總RNA，并利用PrimeScriptII 1st Strand cDNA synthesis Kit(6210A)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別以基因組DNA和cDNA為模板，擴增基因全長及其編碼區(qū)序列。PCR反應體系為20 μL，包括2×KOD buffer 10 μL，dNTP 2 μL，KOD-FX(TOYOBO，上海) 0.4 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddHO補至20 μL。PCR反應程序： 95 ℃ 2 min；98 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min 40 s(基因組DNA)或50 s(cDNA)，35個循環(huán)； 68 ℃ 10 min。PCR反應結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。切膠回收后進行加尾反應，T-A克隆至載體pMD19T，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR和酶切鑒定后送西安擎科澤西生物有限公司測序，測序正確的分別命名為pMD19T-和pMD19T-cds。利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)在線工具對其外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行分析。利用DNAMAN軟件將小麥TaGF14m蛋白與其他物種的同源蛋白序列進行比對分析。

1.2.2 鹽脅迫處理下小麥基因的表達模式分析

將兩葉一心期的中國春小麥幼苗(22 ℃光照16 h/黑暗8 h ，相對濕度為70 %，1/2 Honland營養(yǎng)液培養(yǎng))用0.2 mol·L的NaCl溶液進行處理，分別在處理后的 0、1、3、6、12和24 h取樣，液氮速凍后-80 ℃保存。用RNA提取試劑盒(BioTeke，北京)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以小麥基因為內(nèi)參，以qTaGF14m- F/R為引物，用Talent SYBR green qPCR PreMix (天根，北京)進行qRT-PCR分析，PCR反應體系參照試劑盒說明書，PCR反應程序： 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品三個生物學重復，使用2-△△方法計算相對表達量。

表1 本研究所用引物的信息Table 1 Primers used in the study

1.2.3 小麥基因植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選

以pMD19T-質(zhì)粒為模板，利用帶有Ⅰ和EⅡ酶切位點的引物14m-Ⅰ-F和14m-EⅡ-R擴增基因，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與改造后的pCAMBIA1304載體用限制性內(nèi)切酶Ⅰ和EⅡ進行酶切并回收，使用T連接酶將二者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR篩選和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送西安擎科澤西生物有限公司進行測序，測定正確的命名為pCAMBIA1304-(圖1)。

利用凍融轉(zhuǎn)化法將重組載體pCAMBIA1304-轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，采用花序侵染法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥。通過葉片噴施0.1%的Basta除草劑(有效成分為20%的草胺磷) 進行篩選，并利用引物14m-Ⅰ-F和14m-E Ⅱ-R對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR鑒定，獲得獨立的T代轉(zhuǎn)基因純合株系。利用qRT-PCR檢測T代轉(zhuǎn)基因純合株系中目的基因的表達水平，檢測引物為qTaGF14m-F2/R2，PCR反應體系和程序同1.2.2。

LB：左邊界；35S T Ploy A：35S終止子；Bar：膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(篩選標記基因)；CaMV35S：花椰菜病毒35S強啟動子； Nos T：Nos基因終止子；RB：右邊界。

1.2.4 鹽脅迫處理對過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響

鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察:對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在正常供水條件下培養(yǎng) 3～4周(22 ℃光照16 h/黑暗8 h)后用0.2 mol·L的NaCl溶液澆灌，鹽脅迫13 d后觀察植物表型。將野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子消毒后播種于MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化3 d后，置于22 ℃培養(yǎng)3～5 d，然后將幼苗分別轉(zhuǎn)移至1/2 MS和含100 mmol·LNaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中，豎直培養(yǎng)14 d 后，拍照并測量幼苗的根長。

鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOS途徑相關(guān)基因的表達模式分析:分別在鹽脅迫0、12 d對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片進行取樣，用RNA提取試劑盒(BioTeke，北京)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后利用qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中SOS途徑相關(guān)基因()的表達水平(定量引物序列見表1，PCR反應體系和程序同1.2.2)，結(jié)果以平均值±標準差 表示 。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaGF14m基因的克隆結(jié)果及序列分析

分別以中國春基因組DNA和cDNA為模板擴增基因全長及其編碼區(qū)序列，分別得到1 437和789 bp的目的條帶(圖2)。進一步分析表明，該基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，包含789 bp的開放閱讀框，可編碼262個氨 基酸。

M：DNA marker ；1: TaGF14m的基因組DNA擴增；2： TaGF14m的cDNA擴增。

使用DNAMAN軟件對小麥 TaGF14m蛋白與其他物種的同源蛋白進行多重比對分析，結(jié)果(圖3)顯示，小麥TaGF14m與玉米ZmGF14a、大麥HvGF14b、擬南芥AtGRF7、水稻OsGF14e、二穗短柄草BdGF14e以及烏拉爾圖小麥TuGF14b的相似度較高，其中與烏拉爾圖小麥TuGF14b相似度最高，且所檢測物種中均含有14-3-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

方框表示14-3-3蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域。Ta：小麥；Zm：玉米；HV：大麥；At：擬南芥；Os：水稻；Bd：二穗短柄草；Tu：烏拉爾圖小麥。

2.2 小麥 TaGF14m基因在鹽脅迫處理下的表達模式

利用qRT-PCR對鹽脅迫0、1、3、6、12和 24 h的小麥幼苗葉片中基因的相對表達量進行分析，結(jié)果(圖4)顯示，基因在鹽脅迫1、3、12和24 h均上調(diào)表達，且在鹽脅迫12 h時表達量最高，與0 h之間的差異達顯著水平，表明小麥基因能響應鹽脅迫。

圖柱上無相同字母表示相對表達量在不同處理時間之間差異達顯著水平(P<0.05)。

2.3 植物表達載體pCAMBIA1304-TaGF14m的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選鑒定結(jié)果

表達載體pCAMBIA1304和基因用Ⅰ和EⅡ雙酶切后，用T連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞，挑取單克隆進行菌落PCR和酶切驗證，可以切出pCAMBIA1304載體骨架和1 437 bp的目的條帶，進一步通過測序驗證，成功構(gòu)建了pCAMBIA1304-載體。

利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，通過Basta篩選獲得轉(zhuǎn)基因株系，然后隨機選取8個抗性轉(zhuǎn)基因株系進行PCR檢測，結(jié)果(圖5)顯示，轉(zhuǎn)基因株系均能擴增出1 437 bp的目的條帶，說明均為陽性株系。選取4個獨立的T代轉(zhuǎn)基因純合株系，利用qRT-PCR方法檢測基因的表達水平，結(jié)果(圖6)表明，4個過表達轉(zhuǎn)基因株系OE2、OE4、OE5和OE6中基因的相對表達量均顯著高于野生型。

M：DNA marker；1：野生型；2：H2O(陰性對照)；3～10：轉(zhuǎn)基因植株。

WT代表野生型；OE2、OE4、OE5、OE6代表轉(zhuǎn)基因株系。圖柱上不同字母表示不同株系間差異顯著。圖8同。

2.4 鹽脅迫對過表達 TaGF14m轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響

2.4.1 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型

對正常供水條件下培養(yǎng)3～4周的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥用0.2 mol·LNaCl溶液進行鹽脅迫處理，與野生型相比，鹽脅迫處理13 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥生長明顯受到抑制，葉片發(fā)紫，變黃，植株變矮(圖7)，說明過表達基因使轉(zhuǎn)基因擬南芥的鹽脅迫耐受性降低。

圖7 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫下的表型

將MS上萌發(fā)3～5 d的幼苗轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基以及含100 mmol·LNaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)14 d后，發(fā)現(xiàn)在1/2 MS培養(yǎng)基中，野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥間的根長無顯著差異(圖8左)；而在含100 mmol·LNaCl的1/2MS培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著短于野生型(圖8右)，說明轉(zhuǎn)基因株系對鹽脅迫較為 敏感。

圖8 鹽脅迫對野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥根長的影響

2.4.2 鹽脅迫處理下SOS途徑相關(guān)基因的表達模式

利用qRT-PCR分析野生型與轉(zhuǎn)基因擬南芥株系OE2和OE4在鹽脅迫下SOS途徑三個關(guān)鍵基因(、和)在葉片中的表達模式，結(jié)果(表2)表明，與野生型相比，對照組轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中和基因均上調(diào)表達，且差異達顯著水平，而基因的相對表達量在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系間無顯著差異；鹽脅迫處理組轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中基因下調(diào)表達，和基因均上調(diào)表達，但這三個基因的相對表達量在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系間均無顯著差異，說明轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中、和基因在SOS途徑中的功能不同。與對照組相比，鹽脅迫處理下野生型擬南芥中、和基因均上調(diào)表達，而轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中基因均下調(diào)表達，和基因均上調(diào)表達。以上結(jié)果說明，基因可能參與鹽脅迫信號通路的 調(diào)控。

表2 鹽脅迫處理下SOS途徑相關(guān)基因的相對表達量Table 2 Relative expression of SOS pathway related genes under salt stress

3 討 論

14-3-3蛋白在真核生物中廣泛存在且高度保守，本研究對小麥TaGF14m蛋白及其他物種同源蛋白的序列進行多重比對分析，發(fā)現(xiàn)不同物種同源蛋白間相似度較高，差異主要在分布在N端和C端，這與Yang等報道的14-3-3蛋白主要通過變異性較高的N端和C端來發(fā)揮功能相一致。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥幼苗中基因在鹽脅迫處理下顯著上調(diào)表達，這與其同源基因二穗短柄草基因和水稻基因在鹽脅迫誘導后上調(diào)表達的結(jié)果相一致。

SOS1、SOS2和SOS3蛋白是SOS途徑的三個主要組成部分，SOS1為質(zhì)膜Na/H反向轉(zhuǎn)運蛋白，能夠促進Na的外排；SOS3為鈣結(jié)合蛋白，可以感知鈣信號，與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SOS2相互作用并激活SOS2，進一步通過磷酸化激活SOS1，阻止Na進入胞內(nèi)，促進胞內(nèi)過多的Na外排。14-3-3蛋白λ和k可通過SOS途徑參與植物鹽脅迫響應，例如擬南芥14-3-3蛋白λ和k可與SOS2結(jié)合，抑制其激酶活性，負調(diào)控鹽脅迫耐受性，過表達λ和k可使轉(zhuǎn)基因擬南芥根長和鮮重降低；鹽脅迫處理下，細胞質(zhì)中Ca濃度升高，與14-3-3蛋白結(jié)合，進而抑制14-3-3蛋白與SOS2互作，釋放SOS2，激活PMH-ATP酶和SOS1，進而增加鹽脅迫耐受性。本研究分析了鹽脅迫處理對過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥的影響，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥生長明顯受到抑制；SOS途徑基因表達模式分析表明，正常培養(yǎng)條件下過表達轉(zhuǎn)基因株系和基因的相對表達量顯著高于野生型；而鹽脅迫處理下過表達轉(zhuǎn)基因株系中SOS途徑相關(guān)基因的相對表達量與野生型均無顯著差異，說明基因可能通過SOS途徑負調(diào)控鹽脅迫耐受性，但其脅迫響應機理有待進一步研究。