劉誼蓉， 黃振興

(西寧市第一人民醫(yī)院 腎內(nèi)科， 青海 西寧 810000)

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是公認的終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)患者的腎臟替代療法，PD依靠腹膜(peritoneal membrane，PM)作為超濾和擴散的半透屏障[1-2]。目前，全球約有11%的ESRD患者使用PD[3]。長期PD導致PM間質(zhì)形態(tài)和功能的改變，被定義為PM纖維化(peritoneal fibrosis，PF)，是PM超濾失敗的主要原因[4]。尿毒癥、生物不相容的PD溶液及PM炎癥是PF的已知誘因，PM炎癥是PF發(fā)展過程中的關(guān)鍵事件[5-6]。研究報道核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體參與了心血管和腎臟疾病的無菌炎癥反應[7]。此外，NLRP3本身也被認為參與了腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的信號轉(zhuǎn)導，并促進了腎纖維化[8]。Hautem等[9]報道NLRP3炎癥小體在PD相關(guān)細菌性PM炎的運輸缺陷和形態(tài)改變中起作用。但NLRP3炎性小體在PD相關(guān)PF中的作用仍需進一步研究。因此，本研究旨在探討NLRP3炎性小體在PD相關(guān)PF發(fā)生中的作用，為研究PD相關(guān)PF的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1大鼠和細胞來源 選用健康SD大鼠24只，體質(zhì)量180～200 g，購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證號SCXK(川)2019-189]，飼養(yǎng)于室溫(24±2)℃的環(huán)境中，維持光-暗12 h循環(huán)交替，予以充足的食料和潔凈飲水；人PM間皮細胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMC)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 1.5%、2.5%、4.25%PD液(PD solution，PDS；美國Baxter醫(yī)療)，Dulbecco's modified eagle medium(DEME)培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(美國Hyclone)，胰酶(上海碧云天生物)，蘇木素染液、伊紅染液(珠海貝索生物)，檸檬酸鉛染液(北京中鏡科儀)，四氧化鋨(上海摩貝生物)，RNA Trizol Reagent(合肥博美生物)，TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(北京寶日醫(yī)生物)，相關(guān)一抗NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine aspartate-specific protease-1，Caspase-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor- pr，TGF-β1)及白細胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β；美國Cell Signaling Technology)，生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(英國Abcam)；Western細胞裂解液和二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物)，增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(美國Affinity)；JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡(日本JEOL)，PIKORed 96實時熒光定量(real-time fluorescence quantification，RT-PCR)儀(美國Thermo Fisher)，化學發(fā)光凝膠成像儀5200(上海天能科技)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HPMC細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞長至80%融合時胰酶消化，采用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度約 0.5×102個/L接種于6孔板中，37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待細胞長至80%時待用。

1.2.2細胞鑒定 采用免疫熒光染色對HPMC細胞進行鑒定。在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)浸洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗3次，滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，滴加足夠量的稀釋好的抗波形蛋白抗體(vimentin，Vim)，放入濕盒，4 ℃孵育過夜；PBST浸洗爬片3次，滴加稀釋好的熒光(Cy3)標記羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，加血清封閉30 min，滴加稀釋好的抗細胞角蛋白抗體(pan cytokeratin，PCK)，4 ℃孵育過夜；PBST 浸洗爬片3次，滴加稀釋好的熒光異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記羊抗兔 IgG，37 ℃孵育1 h；滴加4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)避光孵育5 min，對標本進行染核；后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.3細胞分組 取對數(shù)期生長HPMC細胞分為HPMC組(不予以任何處理)、1.50%PDS組(1.50%PDS1.5 mL)、2.50%PDS組(2.50%PDS1.5 mL)、4.25%PDS組(4.25%PDS1.5 mL)、NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染NC-siRNA)、siRNA-NLRP3組(轉(zhuǎn)染siRNA-NLRP3)、siRNA-NLRP3+4.25%PDS組(轉(zhuǎn)染siRNA-NLRP3+4.25%PDS1.5 mL)。1.50%PDS組、2.50%PDS組及4.25%PDS組HPMC細胞分別于1.50%、2.50%及4.25%PDS中培養(yǎng)24 h，NC-siRNA組、siRNA-NLRP3組及siRNA-NLRP3+4.25%PDS組細胞分別采用Lipofectamine?2000按制造商說明用轉(zhuǎn)染NC-siRNA或siRNA-NLRP3或加4.25%PDS，24 h后收集細胞進行后續(xù)分析。

1.2.4透射電鏡觀察 取1.2.3項下各組HPMC細胞經(jīng)3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮脫水，將脫完水的細胞先后經(jīng)脫水劑和環(huán)氧樹脂滲透液，比例分別為3 ∶1、1 ∶1、1 ∶3，30～60 min/步；將滲透好的HPMC細胞塊放于適當模具中，包埋液包埋，加溫聚合形成固體基質(zhì)(包埋塊)；采用超薄切片機制備約50 nm厚的超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛先后染色，室溫下染色15～20 min，透射電鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.5大鼠PF模型構(gòu)建及取樣 大鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機均分為生理鹽水組、1.50%PDS組、2.50%PDS組及4.25%PDS組，每組6只，各組均按100 mL/(kg·d)處理，連續(xù)6周；全程給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進水；4.25%PDS組大鼠死亡1只，其余組無死亡；各組大鼠末次干預后，采用1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，采集各組大鼠PM組織，取70%PM組織置于-20 ℃低溫保存、30%PM組織采用4%多聚甲醛溶液固定，用于后續(xù)實驗。

1.2.6蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 取1.2.5項下各組大鼠PM組織，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm，HE染色，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡檢觀察各組大鼠PM組織的病理學特征。

1.2.7實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測 取1.2.5項下各組大鼠PM組織，使用TRIzol試劑盒按照制造商說明從PM組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，定量基因表達水平。引物序列：NLRP3 正向為5′-AAGAAGAGGAGGAAGTTA-3′，反向為5′-GTCAGATAGTTCAACAAT-3′；TGF-β1 正向為5′-TTAAGCAGCAGAGAC

GACCG-3′，反向為5′-TCACCGGGAACTCTATAGGT-3′；IL-1β正向為5′-GAATCTATACCTGTCTTGTG-3′，反向為5′-TTGAGAAGTGCTGATGTA-3′；GADPH正向為5′-ATCCCATCACCATCTTCCCAG-3′，反向為5′-CCATCACGCCAGTTTTCC-3′。以GAPDH內(nèi)參。qRT-PCR反應條件為95 ℃初始變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s、45個循環(huán)；記錄Ct值，采用2-ΔΔCt分析NLRP3、TGF-β1、IL-1βmRNA的相對表達水平。

1.2.8免疫印跡法(Western blot)檢測 取1.2.3項下各組HPMC細胞及1.2.5項下各組大鼠PM組織，檢測HPMC組、1.50%PDS組、2.50%PDS組HPMC細胞及各組大鼠PM組織中NLRP3和TGF-β1蛋白表達，檢測NC-siRNA組、4.25%PDS組、siRNA-NLRP3組及siRNA-NLRP3+4.25%PDS組HPMC細胞中NLRP3、ASC、Caspase-1、TGF-β1及IL-1β蛋白表達。采用RIPA裂解緩沖液從各組HPMC細胞和PM組織中提取蛋白質(zhì)，冰上孵育，12 000 r/min離心5 min，收集上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度；上清液與十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)樣品加載緩沖液混合，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，將膜與抗NLRP3(1 ∶500)、ASC(1 ∶500)、Caspase-1(1 ∶500)、TGF-β1(1 ∶500)、IL-1β(1 ∶500)或β-actin(1 ∶2 500)的一抗一起于4 ℃孵育過夜；與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯(lián)的二抗(1 ∶3 000)孵育1 h；ECL暗室顯色，使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin為內(nèi)參，對照組目標蛋白質(zhì)相對含量為1，計算蛋白質(zhì)的相對表達量，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 PM組織病理學特征

生理鹽水組大鼠PM組織結(jié)構(gòu)較為完整、清晰，未見明顯增厚；1.50%PDS組大鼠PM組織輕微增厚，間皮細胞排列紊亂甚至缺失，少量纖維組織增生，PM下肌束結(jié)構(gòu)清晰，肌細胞排列較為整齊，未見明顯變性壞死或炎細胞浸潤；2.50%PDS組大鼠PM組織增厚，纖維組織增生較為明顯，間皮細胞基本消失不見，局部可見少量淋巴細胞或中性粒細胞散在分布，PM下肌束結(jié)構(gòu)清晰，肌細胞排列較為整齊，未見明顯變性壞死或炎細胞浸潤；4.25%PDS組大鼠PM組織明顯增厚，間皮細胞基本消失不見，大量纖維組織增生，增生纖維組織較為致密，增生區(qū)域炎細胞浸潤，以淋巴細胞和中性粒細胞為主，局部區(qū)域可見少量血管增生。見圖1。

圖1 各組大鼠PM組織學特征(HE染色)Fig.1 Histological characteristics of rat PM tissues in each group (HE staining)

2.2 PM組織NLRP3炎癥小體的表達

與生理鹽水組比較，4.25%PDS組大鼠PM組織NLRP3、TGF-β1及IL-1βmRNA表達增加(P<0.05)，2.50%PDS組大鼠PM組織NLRP3和TGF-β1 mRNA表達增加(P<0.05)、但IL-1βmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，1.50%PDS 組大鼠PM組織NLRP3、TGF-β1及IL-1βmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與生理鹽水組比較，4.25%PDS組和2.50%PDS組大鼠PM組織NLRP3、TGF-β1蛋白表達增加(P<0.05)，1.50%PDS 組NLRP3、TGF-β1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：A為mRNA表達定量結(jié)果，B、C分別為蛋白條帶檢測結(jié)果及其灰度值定量結(jié)果；(1)與生理鹽水組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠PM組織NLRP3炎癥小體的表達Fig.2 Expression levels of NLRP3 inflammasome in rat PM tissues in each group

2.3 各組HPMC細胞中NLRP3炎癥小體的表達

細胞鑒定結(jié)果顯示，Vimentin (紅色熒光)和PCK(綠色熒光)雙陽性率>90%，即細胞純度>90%；電鏡觀察結(jié)果顯示HPMC組HPMC細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常、細胞核呈不規(guī)則多邊形、染色質(zhì)分布均勻、以常染色質(zhì)為主且核膜完整，1.50%PDS組和2.50%PDS組HPMC細胞核呈不規(guī)則多邊形、染色質(zhì)分布均勻、以常染色質(zhì)為主、胞漿中可見細胞器(線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和核糖體等)且結(jié)構(gòu)完整清晰且可見少量自噬，4.25%PDS組HPMC細胞核膜完整、細胞器結(jié)構(gòu)完整清晰、細胞中積累了與自噬相關(guān)的結(jié)構(gòu)和凋亡空泡；Western blot檢測結(jié)果顯示，與HPMC組比較，2.50%PDS組和4.25%PDS組HPMC細胞NLRP3和TGF-β1蛋白表達明顯升高(P<0.01)。見圖3。

注：A為細胞鑒定結(jié)果(紅色熒光為Vim陽性，綠色熒光為PCK陽性；DAPI是細胞核染料，Merge為DAPI和免疫熒光染色的融合圖；200×)，B為電鏡觀察結(jié)果(6 000×)，C、D分別為蛋白條帶檢測結(jié)果及其灰度值定量結(jié)果；(1)與HPMC組比較，P<0.05。圖3 各組HPMC細胞NLRP3炎癥小體的表達Fig.3 Expression levels of NLRP3 inflammasome in HPMC cells in each group

2.4 細胞PF和NLRP3炎癥小體的表達

電鏡觀察結(jié)果顯示，NC-siRNA組、4.25%PDS組、siRNA-NLRP3組及siRNA-NLRP3+4.25%PDS組HPMC細胞細胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)都較完整，但4.25%PDS組HPMC細胞胞漿中含大量空泡；除NC-siRNA組外，其余3組HPMC細胞均存在不同程度的自噬，siRNA-NLRP3+4.25%PDS組HPMC細胞自噬程度減輕(圖4A)。Western blot檢測結(jié)果顯示與NC-siRNA組比較，4.25%PDS組HPMC細胞NLRP3、ASC、Caspase-1、TGF-β1及IL-1β蛋白表達升高(P<0.05)；與4.25%PDS組比較，siRNA-NLRP3+4.25%PDS組HPMC細胞中NLRP3、ASC、Caspase-1及TGF-β1蛋白表達降低(P<0.05，圖4B和圖4C)。

注：A為電鏡觀察結(jié)果(6 000×)，B、C分別為蛋白條帶檢測結(jié)果及其灰度值定量結(jié)果；(1)與NC-siRNA組比較，P<0.05；(2)與4.25%PDS組比較，P<0.05。圖4 NLRP3對細胞PF和NLRP3炎癥小體表達的影響Fig.4 Effect of NLRP3 expression on cellular PF and NLRP3 inflammasome expression

3 討論

在長時間的PD過程中，高糖PDS會加重PF，導致PD效果降低和超濾失敗，目前PD相關(guān)PF的機制仍有待闡明[10]。有研究顯示影響PD治療的關(guān)鍵因素是PM結(jié)構(gòu)和功能的改變，長期PD患者的PM組織伴隨PF的形成，在患者發(fā)生嚴重或反復發(fā)生PM炎時更加明顯，而反復發(fā)生的PM炎是導致人PM間皮細胞(human peritoneal mesothelial cells，HPMCs)發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的主要原因，最終導致超濾衰竭使患者透析終止[11]。此外，有研究顯示NLRP3炎癥小體在介導組織損傷引起的無菌性炎癥中起重要作用，NLRP3是核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族成員，可募集ASC及Caspase-1組成多蛋白復合體-NLRP3炎癥小體，由于Caspase-1是一種IL-1β轉(zhuǎn)換酶，NLRP3炎癥小體激活Caspase-1，Caspase-1進而誘導IL-1β前體進入成熟狀態(tài)，進而導致組織炎癥和損傷[12-16]。體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可呈劑量依賴性地誘導腎小管等發(fā)生 EMT，PDS可呈時間和劑量依賴性活化HPMCs的NLRP3，誘導HPMCs發(fā)生 EMT，將si-NLRP3轉(zhuǎn)染至HPMCs發(fā)現(xiàn)可部分抑制含糖PD液誘導的PF[17]。此外，NLRP3炎癥小體的激活也會觸發(fā)炎癥細胞死亡[18]。有研究表明，NLRP3炎癥小體是包括痛風、動脈粥樣硬化、2型糖尿病及代謝綜合征等多種疾病的關(guān)鍵介質(zhì)，且可參與纖維化因子的表達和組織纖維化的發(fā)展[19-22]。PDS誘導PF大鼠模型顯示了PD相關(guān)性PF的一些組織學特征，所以適合于研究PD相關(guān)性PF的發(fā)病機制[23]。本研究采用不同濃度PDS誘導大鼠PF，結(jié)果顯示4.25%PDS可明顯導致PM組織損傷，增加NLRP3和TGF-β1蛋白表達。這一結(jié)果與Hautem等[9]研究一致。HPMC是PM結(jié)構(gòu)的主要組成部分，因此HPMCs的細胞功能水平對透析充分性起著關(guān)鍵作用[24]。本研究采用不同濃度PDS干預HPMC，發(fā)現(xiàn)4.25%PDS處理后細胞中積累了與自噬相關(guān)的結(jié)構(gòu)和凋亡空泡，并較HPMC組NLRP3、TGF-β1蛋白表達明顯升高，而NLRP3抑制可以減輕細胞自噬程度及明顯降低NLRP3、ASC、Caspase-1及TGF-β1蛋白表達，提示NLRP3炎性小體參與了PD相關(guān)性PF的過程，抑制NLRP3可減輕HPMC自噬程度。雖然本研究已表明抑制NLRP3可減輕PDS誘導的PF細胞自噬，但其機制仍有待闡明。最近有研究表明，NLRP3炎性小體的激活通過裂解Gasdermin D誘導了一種特殊形式的細胞死亡，稱為細胞焦亡[25-26]；另一方面ASC還參與了其他類型的細胞死亡，如Caspase-8介導的凋亡或壞死[27]。因此，需要進一步研究NLRP3炎癥小體在PD相關(guān)PF中的確切機制和作用。

綜上所述，本研究表明NLRP3炎癥小體在PD相關(guān)PF中有著重要作用，提示NLRP3炎癥小體是預防和治療PD相關(guān)PF的潛在靶點，但NLRP3炎癥小體的確切機制仍需進一步研究。