李 祥，安雅婷，周 淼

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

消炎止痛膏（津藥制字Z20070286號(hào)）為天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由木瓜、大黃、醋乳香、醋沒藥、蒲公英等7味中藥組成。消炎止痛膏為外用軟膏劑，涂敷于患處，應(yīng)用于跌打損傷及瘡瘍腫毒，具有活血散瘀、清熱消腫止痛的功效。消炎止痛膏在臨床應(yīng)用多年，安全有效，無明顯不良反應(yīng)，深受患者歡迎。消炎止痛膏中蒲公英是一種常見的中草藥，富含多糖、咖啡酸、綠原酸、總黃酮等多種活性成分［1］。蒲公英能夠清熱解毒、活血止痛，現(xiàn)代藥理研究表明，蒲公英具有廣譜殺菌和抑菌作用，具有“天然抗生素”之美譽(yù)。這些藥理作用與酚酸類物質(zhì)有一定關(guān)系［2］。咖啡酸是蒲公英所含的主要成分之一，也是消炎止痛膏發(fā)揮藥效的主要活性成份。

本文以咖啡酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用超高效液相色譜法測定咖啡酸含量，優(yōu)化消炎止痛膏巴布膏劑提取工藝。

1 設(shè)備與材料

1.1 設(shè)備儀器 ACQUITY UPLCTMI-Class System超高效相色譜儀（美國Waters公司），HWS-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱（中國北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），Smart2Pure超純水儀（美國賽默飛公司），WGLL-125BE鼓風(fēng)干燥箱（中國天津泰斯特公司），Sorvall Legend Micro 21微量離心機(jī)（美國賽默飛公司），AS62.R2十萬分之一天平（波蘭RADWAG公司），渦旋儀（中國江蘇天翎儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品 大黃（批號(hào)121200401，產(chǎn)地：青海，購于北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司），蒲公英（咖啡酸含量為337.43μg/g，批號(hào)21051511，產(chǎn)地：甘肅省天水市，購于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司），木瓜（批號(hào)388210401，產(chǎn)地：安徽，購于北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司），梔子（批號(hào)585210401，產(chǎn)地：浙江，購于北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司），土鱉蟲（批號(hào)2101012-01，產(chǎn)地：江蘇，購于天津中藥飲片廠有限公司），乳香（批號(hào)201203207，產(chǎn)地：埃塞俄比亞，購于天津市中藥飲片廠有限公司），沒藥（批號(hào)2012068-03，產(chǎn)地：索馬里，購于天津市中藥飲片廠有限公司），上述藥材經(jīng)天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院孫浩主任中藥師鑒定、藥檢室檢測均符合《中國藥典》2020年版［3］及《天津市中藥飲片炮制規(guī)范》2018年版的要求；咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-201703，中國食品藥品檢定研究院）。甲酸、甲醇等均為分析純，乙腈（天津康科德科技有限公司）為色譜純，水為超凈水。水提樣品（S1，批號(hào)20121；S2，批號(hào)201214；S3，批號(hào)201215。均為本院制劑室提供），醇提樣品（C1，批號(hào)201216；C2，批號(hào)201217；C3,批號(hào)201218。均為本院制劑室提供）。

2 制劑處方

大黃260 g、蒲公英100 g、木瓜100 g、土鱉蟲46 g、乳香46 g、沒藥46 g、梔子46 g。

3 含量測定方法建立

3.1 溶液的制備

3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇將其定容至5 ml量瓶中，配置為濃度為1.02 mg/ml對(duì)照品溶液。

3.1.2 供試品溶液的制備 水提液以甲醇稀釋2倍后，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清液，過0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液；醇提液以乙醇滲漉樣品溶液100 ml濃縮后以甲醇定容于25 ml量瓶中，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清液，過0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。

3.1.3 陰性樣品溶液的制備 取不含蒲公英提取液適量，置量瓶中加5%甲醇水溶液至刻度。

3.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7μm）色譜柱，柱溫：45℃，樣品室溫度：4℃，進(jìn)樣體積：2μl，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序如表1所示。流速：0.3 ml/min。檢測波長：320 nm。在此色譜條件下，咖啡酸與其他成分可以有效地進(jìn)行分離，陰性樣品對(duì)測定無干擾。見圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 對(duì)照品（A）水提供試品（B）醇提供試品（C）陰性樣品（D）UPLC色譜圖

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取“3.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，將其稀釋為不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以濃度為X軸，峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=36 652.543 1 X-5 463.025 4（r=0.999 9）。在0~70μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取“3.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，在上述色譜條件下測定，計(jì)算峰面積RSD值為0.20%，表明精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性考查 精密取同一份樣品，按“3.1.2”制備供試品溶液，于處理后0、2、4、6、8、12和24 h分別進(jìn)樣，在上述色譜條件下測定，計(jì)算峰面積RSD值為0.53%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批樣品，按“3.1.2”制備供試品溶液，平行6份，處理后在上述色譜條件下測定，分別進(jìn)樣5μl測定，RSD值為0.44%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的樣品，平行6份，精密加入對(duì)照品溶液1 ml，按“3.1.2”制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測定，平均回收率為88.04%，RSD值為2.95%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)表明，建立的咖啡酸含量測定方法可行。加樣回收率結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 提取方法

4.1 水提工藝 取蒲公英100 g，按處方量將7味飲片加適量水浸泡后，再加適量水，煎煮，合并煎液過濾。

4.2 醇提工藝 取蒲公英100 g，按處方量將7味飲片加不同濃度乙醇溶液浸泡后，過濾。

5 提取工藝優(yōu)化

5.1 水提工藝正交設(shè)計(jì) 確定浸泡時(shí)間（A）、煎煮次數(shù)（B）、煎煮時(shí)間（C）、加水量（D）作為影響因素，采用4因素3水平正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，因素水平見表3，結(jié)果見表4。從試驗(yàn)結(jié)果可見，4個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小分別為：煎煮次數(shù)（B）＞加水量（D）＞煎煮時(shí)間（C）＞浸泡時(shí)間（A），最佳成型工藝參數(shù)為A2B3C2D2，即浸泡2 h、煎煮3次、每次煎煮2 h、加8倍量的水。

表3 因素水平

表4 正交設(shè)計(jì)與結(jié)果

5.2 乙醇浸提法工藝優(yōu)化 確定浸泡時(shí)間（A）、乙醇濃度（B）、液料比（C）作為影響因素，采用3因素3水平正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，因素水平見表5，結(jié)果見表6。從試驗(yàn)結(jié)果可見，3個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)分的影響大小分別為：浸泡時(shí)間（A）＞乙醇濃度（B）＞液料比（C），最佳成型工藝參數(shù)為A3B3C2，即浸泡72 h、加8倍量90%的乙醇。

表5 因素水平

表6 正交設(shè)計(jì)與結(jié)果

5.3 兩種最佳提取工藝的比較 按兩種提取方法分別確定的最佳工藝所得3批樣品，測定咖啡酸含量，結(jié)果水提工藝的咖啡酸提取率高于乙醇浸提法。見表7。兩種工藝比較結(jié)果表明，水提工藝的咖啡酸提取率高于乙醇浸提法，故確定水提工藝為消炎止痛膏巴布膏劑提取工藝。其影響因素順序依次為：煎煮次數(shù)＞加水量＞煎煮時(shí)間＞浸泡時(shí)間；采用提取方法為加8倍量的水，浸泡2 h，煎煮3次，每次煎煮2 h。

表7 兩種提取方法最佳提取工藝咖啡酸含量比較

6 討論

6.1 浸泡時(shí)間 干燥飲片若不先用清水浸泡而直接以急火煎煮，會(huì)使藥材表面所含的蛋白質(zhì)凝固，淀粉糊化，甚至阻塞藥材的毛細(xì)管孔隙，造成中藥材里有效成分不易溶出。在煎煮之前應(yīng)用清水浸泡一段時(shí)間，使藥材因吸足水分而軟化，細(xì)胞膨脹，有效成分逐漸溶解進(jìn)入水中。這樣再進(jìn)行煎煮，隨著水溫逐漸升高，細(xì)胞進(jìn)一步膨脹，藥材的有效成分就能更快、更完全的溶解在藥液當(dāng)中，增進(jìn)湯劑的療效。本研究通過正交實(shí)驗(yàn)表明，消炎止痛膏巴布膏劑的浸泡時(shí)間為2 h。

6.2 測定方法 本研究中采用UPLC方法建立了消炎止痛膏巴布膏劑中咖啡酸含量測定的方法。UPLC方法因?yàn)槠渖V柱填料粒徑更?。?.7μm）、檢測器采樣速度快等原因，其相比傳統(tǒng)的高效液相色譜法具有高分離度、高速度以及高靈敏度的優(yōu)勢。在本試驗(yàn)中，UPLC的使用提高了分離度，改善了峰形，且極大的提高了樣品分析效率。

6.3 提取方法篩選 本研究采用了水及不同濃度的乙醇對(duì)消炎止痛膏處方進(jìn)行提取，由于消炎止痛膏處方中含有乳香、沒藥，二者均為樹脂類藥物，其在乙醇體系中有效成分難以溶出，因此，本研究在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，考慮到中藥復(fù)方的療效為多種藥物協(xié)同發(fā)揮作用，乳香［4-6］及沒藥［7］作為活血止痛藥是本方的重要組成藥物，因此選擇水為提取溶劑。