吳天昊，翟敏，胡龍嬌，宣繼萍，巨云為，何姣

(1.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇南京 210037；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014)

薄殼山核桃Carya illinoinensis又名美國山核桃，為胡桃科Juglandaceae山核桃屬Carya植物，原產(chǎn)于美國和墨西哥北部[1]，是世界上重要的油料干果樹之一，也是我國近十幾年廣泛栽培的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)林樹種。其木材是上等的軍工用材，果實(shí)醇香干脆、美味可口，作為調(diào)味食品廣泛應(yīng)用于餐飲行業(yè)，對人體具有很好的保健功效[2]。薄殼山核桃樹形高大挺秀，能適應(yīng)潮濕的土壤，擁有較為強(qiáng)壯的根系，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會效益[3]。然而隨著薄殼山核桃種植面積不斷擴(kuò)大，病蟲害逐漸成為影響其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。目前薄殼山核桃病害主要有真菌、細(xì)菌和線蟲病害，其中真菌病害占比最大，多以黑斑病、褐斑病、白粉病為主[4]。

趙玉梅等[5]認(rèn)為薄殼山核桃黑斑病屬于細(xì)菌性病害，其病原為黃單胞桿菌Xanthomonas campestris pv.Juglandis，X.campestris與伴生致病真菌鏈格孢菌Alternaria spp.復(fù)合侵染引起山核桃黑斑病和褐斑病。孟珂[6]認(rèn)為炭疽菌Colletorichum spp.是引起薄殼山核桃黑斑病的主要菌種，在其分離得到的菌種中炭疽菌占比最大，屬于優(yōu)勢種，并且證實(shí)了該菌對葉片和果實(shí)都具有侵染性。張傳清 等[7]報(bào)道了小孢擬盤多毛孢Pestalotiopsis microspora可以侵染薄殼山核桃果實(shí)從而引起黑斑病，戚錢錢[8]也認(rèn)為山核桃黑斑病病原為P.microspora，主要危害果實(shí)和葉片。筆者將危害薄殼山核桃葉片的病害統(tǒng)稱為葉斑病。

當(dāng)前我國對薄殼山核桃葉斑病的研究比較滯后，不僅對病原菌的研究不夠深入，而且對病原鑒定準(zhǔn)確性也存較大疑問。筆者以江蘇省南京市六合區(qū)、鎮(zhèn)江市句容市和安徽省滁州地區(qū)的薄殼山核桃葉斑病為研究對象，旨在通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法來確定薄殼山核桃葉斑病的病原菌種類，為深入探討該病的致病機(jī)制與有效防治技術(shù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年7—8月，在南京六合區(qū)山北村西面山腳下(32°20′16″N，118°53′43″E)、鎮(zhèn)江句容市白兔鎮(zhèn)大蔣莊(31°57′38″N，119°18′56″E)，安徽省滁州市薄殼山核桃基地(32°34′47″N，119°8′15″E)采集感病薄殼山核桃葉片。薄殼山核桃葉斑病田間癥狀有2種，一種是在發(fā)病初期，山核桃葉片上出現(xiàn)黑色小圓點(diǎn)，隨后逐漸分散展開，病斑逐漸擴(kuò)大，呈現(xiàn)黑色的不規(guī)則圓斑，后期病斑擴(kuò)展到整個(gè)葉片(圖1A)；另一種在葉片上產(chǎn)生褐色小斑，后期逐漸擴(kuò)散，密布在葉脈兩側(cè)，最后造成葉片枯萎卷縮直至凋落死亡(圖1B)。

圖1 薄殼山核桃葉斑病田間癥狀Fig.1 Symptoms of leaf spot of Carya illinoensis in field

1.2 病原菌的分離純化

將田間不同感病癥狀的薄殼山核桃葉片分別進(jìn)行組織消毒[6]，在葉斑的病健交界處用組織分離法分離病原菌，在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d后，劃取菌落邊緣菌絲，將其轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行多次純化并保存。

1.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

菌株在PDA上活化后，制成直徑5 mm的菌餅將其轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。每隔1 d用十字交叉法測量1次菌落直徑，最后分別計(jì)算菌株生長速率。待病原菌產(chǎn)孢后，用蔡司顯微鏡(Imager.M2，zeiss)觀察孢子形態(tài)及其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，對病原菌進(jìn)行形態(tài)鑒定[9-11]。將形態(tài)鑒定后的病原菌分別各選1株，將其編號為 JR1，JR2，LHH 和 AH3。

1.4 致病性試驗(yàn)

將直徑5 mm的菌餅分別接種于2 a生薄殼山核桃幼苗。用高溫滅菌后的針孔刺傷健康薄殼山核桃幼苗葉片，將長有菌絲的一面放置在傷口，用直徑5 mm的無菌PDA瓊脂塊作為空白對照，每株苗只接1種菌，將接種后的幼苗放入濕度98%以上、溫度25～28℃的溫室內(nèi)，5～7 d后觀察葉片發(fā)病情況。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種12片葉。對接種后發(fā)病的山核桃葉片，再次分離病原菌。根據(jù)柯赫氏法則，若分離的菌株與原接種菌株一致，則可確定該菌為薄殼山核桃葉斑病的病原菌。

1.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定

從菌落表面取少量菌絲，采用CTAB法提取真菌DNA。采用引物 TEF1/TEF2和 RPB2-5f2/RPB2-7cr[12]對菌株 JR1進(jìn)行片段擴(kuò)增；采用ITS1/ITS4[13]對JR2進(jìn)行擴(kuò)增；采用 ITS1/ITS4和Bt2a/Bt2b[14]對LHH進(jìn)行擴(kuò)增；采用ITS1/ITS4和HSP60-F/HSP60-R[15]對 AH3進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測并送往上海杰李生物科技有限公司測序。

將測序獲得的各病原菌基因序列在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中進(jìn)行BLAST比對，并在Genbank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性對比分析，下載相似度較高的參考序列，并運(yùn)用Phylo-Suite軟件基于最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

從田間采集的2種病葉中共分離到96株菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，初步確定為9株鐮孢屬Fusarium真菌(代表菌株JR1)、7株暗球腔菌屬Phaeosphaeria真菌(代表菌株JR2)、19株葡萄座腔菌Botryosphaeria真菌(代表菌株LHH)、12株葡萄孢屬Botrytis真菌(代表菌株 AH3)，分離率依次為 9.3%，7.2%，19.8%，12.5%。

27℃下，菌株JR1在PDA上平均生長速率為1.4 cm/d，菌絲初期呈乳白色并向四周均勻擴(kuò)散，3 d后菌落中間開始產(chǎn)生磚紅色的色素(圖2A)。JR1的孢子類型有2種，一種為分生孢子，另一種為厚垣孢子。分生孢子中，大孢子鐮刀狀，透明或半透明，3～5個(gè)隔膜，(24.86～32.94)μm×(3.63～4.16)μm；小孢子單細(xì)胞，長橢圓形，透明或半透明，(4.46～11.23)μm×(2.28～3.80)μm(圖2B)。 厚垣孢子單生(圖2C)。結(jié)合菌株 JR1的菌落形態(tài)，根據(jù)BOOTH分類系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法[9]，初步鑒定為鐮孢菌屬Fusarium。

圖2 菌株JR1培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)Fig.2 Culture characteristics and spores morphology of the strain JR1

菌株JR2生長較為緩慢，平均生長速率為0.6 cm/d，菌絲初期呈白色，后逐漸變灰色，菌落呈不規(guī)則圓形，培養(yǎng)基背面為暗黑色(圖3A)。JR2的孢子長棒狀，彎曲或不彎曲，頂部鈍圓(圖3B)，(17.26～25.04)μm ×(3.19～3.68)μm，分生孢子梗聚生成環(huán)形墊狀的分生孢子座(圖3C)。結(jié)合菌株JR2的菌落形態(tài)，參照真菌鑒定手冊[10]，初步鑒定為暗球腔菌屬Phaeosphaeria。

圖3 菌株JR2培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)Fig.3 Culture characteristics and spores morphology of the strain JR2

菌株LHH平均生長速率為1.85 cm/d，菌絲初期純白色，之后逐漸暗沉直至變成深褐色，菌絲外圍菌絲呈絮狀，氣生菌絲發(fā)達(dá)(圖4A)。LHH的子座為黑色球狀(圖4B)，分生孢子座環(huán)形透明，孢子長橢圓形，透明無色(圖4C)，(15.92～18.87)μm ×(4.53～6.98)μm。結(jié)合菌株LHH的菌落形態(tài)，根據(jù)趙嘉平的分類方法[11]，初步鑒定為葡萄座腔菌屬Botryosphaeria。

圖4 菌株LHH培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)Fig.4 Culture characteristics and spores morphology of the strain LHH

菌株AH3平均生長速率1.07 cm/d，菌絲初期呈淡橘紅色，質(zhì)地較硬，放射狀同心圓生長，氣生菌絲較少(圖5A)，培養(yǎng)10 d左右出現(xiàn)黑色菌核，菌絲的顏色也變?yōu)榛野咨?圖5B)。分生孢子生于分生孢子梗分枝末端的膨大體表面，呈葡萄串狀(圖5C)，單孢，卵圓狀或橢圓狀，幾乎無色或略顯淡色，有內(nèi)核(圖 5D)，(6.72～9.86)μm ×(9.00～13.48)μm。結(jié)合菌株AH3的菌落形態(tài)，參照真菌鑒定手冊[10]，初步鑒定為葡萄孢屬Botrytis。

圖5 菌株AH3培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)Fig.5 Culture characteristics and spores morphology of the strain AH3

2.2 病原菌致病性

將病原真菌的代表菌株JR1，JR2，LHH，AH3的菌餅分別接種于2 a生薄殼山核桃葉片7 d后，接種JR1的葉片出現(xiàn)大面積圓形的黑色病斑，直徑3.2～3.4 cm，葉片背面出現(xiàn)肉色的孢子堆(圖6A)，發(fā)病率90.9%；接種JR2和LHH的葉片均出現(xiàn)黑斑，但與JR1相比黑斑面積較小，接種JR2后黑斑直徑為2.4～2.7 cm(圖6B)，發(fā)病率100%；接種 LHH后葉片發(fā)病但不明顯，病斑直徑0.3～0.5 cm(圖6C)，發(fā)病率75.0%；接種AH3的葉片出現(xiàn)淡褐色圓斑，直徑1.2～1.8 cm(圖6D)，病斑處葉片發(fā)脆，發(fā)病率100%。對照組葉片未感病。將接種發(fā)病葉片再次進(jìn)行病原菌分離，分離到的病原菌與野外采集病葉上分離到的一致。

圖6 薄殼山核桃葉片接種病原菌7 d后發(fā)病癥狀Fig.6 Symptoms of leaves of Carya cathayensis after 7 days inoculated with four strains

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

菌株JR1的TEF和RPB2序列上傳至NCBI后登錄號分別為MZ416740和MZ416741，串聯(lián)TEF和RPB2構(gòu)建菌株JR1的系統(tǒng)發(fā)育樹。JR1與參考菌株共享鐮孢菌Fusarium commune B9s5、F.commune LN-15-1、F.commune LN-15-2 聚在一個(gè)分支上，節(jié)點(diǎn)支持率BS=89(圖7)。

圖7 基于TEF和RPB2串聯(lián)基因構(gòu)建菌株JR1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on TEF and RPB2 genes of the strain JR1

菌株JR2的ITS序列登錄號為MZ411430，構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。JR2與暗球腔菌屬下的Phaeosphaeria fuckelii F22、P.fuckelii 39 CCA同源性較近，處于一個(gè)分支，節(jié)點(diǎn)支持率BS=97(圖8)。

圖8 基于ITS基因構(gòu)建菌株JR2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on ITS gene of the strain JR2

菌株LHH的ITS和TUB2序列登錄號分別為MZ416742和MZ399200，串聯(lián)兩基因后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。LHH與茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea ZB-49、B.dothidea ZB-2、B.dothidea ZB-70同源性較近，節(jié)點(diǎn)支持率BS=86(圖9)。

圖9 基于ITS和TUB2串聯(lián)基因構(gòu)建菌株LHH的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree based on ITS and TUB2 genes of the strain LHH

菌株AH3的ITS和HSP60序列登錄號分別為MZ416739和MZ411430，串聯(lián)兩基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。AH3與灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea PVUPG 238、B.cinerea PVUPG 207、B.cinerea PVUPG 212同源性較近，處于一個(gè)大分支，AH3與B.cinerea PVUPG 238又單獨(dú)聚為一個(gè)小分支，節(jié)點(diǎn)支持率BS=94(圖10)。

圖10 基于ITS和HSP60串聯(lián)基因構(gòu)建菌株AH3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree based on ITS and HSP60 genes of the strain AH3

3 結(jié)論和討論

目前薄殼山核桃葉斑病的病原有多種，不同的病原致病性也不同。本研究中，從薄殼山核桃葉斑病的病葉共分離獲得96株菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定和分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)4種致病真菌，分別為共享鐮孢菌Fusarium commune、Phaeosphaeria fuckelii、茶藨子葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea。

鐮孢屬可以引起多種植物病害。Chen等[16]在胡桃木莖潰瘍病中分離到茄病鐮孢菌Fusarium solani并證實(shí)了其為病原菌；尖孢鐮孢Fusarium oxysporum能夠使兜蘭Paphiopedilum葉片萎蔫枯死、根莖腐爛，引起兜蘭萎蔫病[17]，嚴(yán)重影響其觀賞性，還能引起甜瓜枯萎病，使甜瓜主根及果實(shí)腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[18]。鐮孢屬真菌寄主范圍較為廣泛，但是國內(nèi)還未見其侵染薄殼山核桃葉片的報(bào)道。

暗球腔菌屬真菌Phaeosphaeria spp.是多種植物病害的病原菌，分布在世界各地，可以侵染香蕉，使其形成葉斑，干枯、發(fā)黑、減少香蕉的光合作用，嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量與質(zhì)量[19]；還可以侵染竹葉形成竹葉枯型叢枝病，對淡竹Phyllostachys glauca、桂竹P.bambusoides危害最為嚴(yán)重[20]，該屬的其他一些真菌亦可以引起谷類葉枯病[21]。筆者從薄殼山核桃葉片分離得到的菌株JR2為Phaeosphaeria fuckelii，發(fā)現(xiàn)其可以危害薄殼山核桃葉片，并且是一種致病性很強(qiáng)的新病原，應(yīng)當(dāng)引起重視。

據(jù)報(bào)道，茶藨子葡萄座腔菌B.dothidea，在山核桃枝干上具有極大的致病性，是一種常見的林木干腐病菌[22]。B.dothidea在大量健康的植物上也可以被分離得到，說明該菌可以作為多數(shù)植物的內(nèi)生真菌[23]，但其對于某些特定的寄主卻可以造成毀滅性的打擊。國內(nèi)有多數(shù)研究表明B.dothidea對山核桃、楊樹、桃樹等的枝干具有極大的致病性[23-24]。本研究中，B.dothidea對薄殼山核桃葉片具有一定的致病性且分離率較高，雖然其發(fā)病率與發(fā)病面積相較于其他3種病原菌略低，致病性最弱，但在防治薄殼山核桃葉斑病時(shí)，仍不容忽視。

薄殼山核桃褐色葉斑多見于葉片、果實(shí)和嫩梢，病斑外圍常常伴有黃色暈圈，病葉枯死脫落，果實(shí)產(chǎn)量受到影響。楊莉等[25]在對四川核桃褐斑病的病原菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定后，確定了其病原菌為鏈格孢菌Alternaria alternata；核桃日規(guī)殼 Gnomonia leptostyla也可以引起核桃褐斑病[26]。本研究中，灰葡萄孢B.cinerea對薄殼山核桃葉片具有致病性，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)褐色病斑。

薄殼山核桃葉斑病的發(fā)生還與其他多種因素有關(guān)。有研究表明，薄殼山核桃葉斑病發(fā)病率與海拔高度呈負(fù)相關(guān)[26]；酸性土壤比堿性土壤更容易引發(fā)薄殼山核桃葉斑病[27]，因此低海拔堿性土壤種植薄殼山核桃可以減少葉斑病的發(fā)生。目前關(guān)于F.commune、P.fuckelii、B.dothidea、B.cinerea 侵染薄殼山核桃引起葉斑病還未見有詳細(xì)的報(bào)道，有待今后深入研究。