李少華，韓錦斌，陳榮冰*，王飛權(quán)，馮花，郞巖

(1.武夷學(xué)院 旅游學(xué)院，福建 武夷山 354300；2.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300)

我國是茶樹的發(fā)源地，茶園栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列，主要分布于我國長江以南地區(qū)。通常茶樹每年會(huì)經(jīng)歷3～4輪新梢萌發(fā)生長，由此加工所得茶葉通常稱為春茶、夏茶和秋茶。茶樹春梢由于內(nèi)含物豐富，比例協(xié)調(diào)，常作為名優(yōu)茶生產(chǎn)原料，是茶農(nóng)的最主要經(jīng)濟(jì)來源[1]，夏秋茶梢由于品質(zhì)較差，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低棄采現(xiàn)象普遍[2]，而為保證來年春茶的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，通常在秋季對(duì)茶樹進(jìn)行修整及田園管理，茶樹修剪可增加茶樹經(jīng)濟(jì)年齡，又能促進(jìn)新梢發(fā)育、復(fù)壯重組樹冠[3]。

茶葉在我國的藥用歷史已有上千年?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》《新修本草》《太平圣惠方》《食療本草》《令媛要方》《和劑局方》等醫(yī)書均有關(guān)于茶葉功效的記載。茶葉的主要生物活性成分是茶多酚(teapolyphenols，TP)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茶多酚具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、防癌、抑菌、抗輻射、抗病毒、解毒、降血脂和血糖、抗衰老等方面作用[4-9]，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。夏秋茶產(chǎn)量約占全年茶葉總產(chǎn)量60%，原料豐富，且夏秋季節(jié)由于光照較長，氣溫較高，茶樹體內(nèi)碳代謝較為旺盛，多酚物質(zhì)積累較高[10]，因此將茶樹修剪廢棄物作為活性物質(zhì)提取原料，既不增加茶農(nóng)工作量，又可提高茶樹資源利用率，還能增加茶農(nóng)收益。當(dāng)前茶多酚的主要制備方法是將干茶副產(chǎn)物粉碎后采用有機(jī)溶劑提取制備而得，而將茶樹修剪鮮葉作為直接提取原料，尚未見報(bào)道。

以秋季茶樹修剪鮮葉為原料，采用多重響應(yīng)面法和Box-Behnken設(shè)計(jì)，考察提取變量與茶多酚提取率的關(guān)系，確定茶樹修剪鮮葉中茶多酚提取的最佳工藝條件。

1 材料與儀器

1.1 儀器

UV-1880型紫外分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；Sartorius BS224S電子天平，賽多利斯公司；JYL-Y92S破壁機(jī)，九陽股份有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZFDA5040A型鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Unicen MR離心機(jī)，德國Herolab公司；Kertone Lab MINI-DI超純水機(jī)，湖南科爾頓水務(wù)有限公司。

1.2 材料

沒食子酸對(duì)照品，批號(hào)：M-017-181216，成都瑞芬思生物科技有限公司；茶鮮葉，武夷學(xué)院武夷茶學(xué)科教園10月水仙茶樹修剪鮮葉，經(jīng)福建省農(nóng)科院茶葉研究所陳榮冰研究員鑒定；福林酚、碳酸鈉等試劑，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 茶葉勻漿的制備

將修剪下來的茶葉，摘取新梢部分，置于微波爐中殺青5min，加適量水放入破壁機(jī)中研磨成茶漿，將制好的茶葉原漿放入磨砂廣口瓶中，置于-20℃的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取0.110 g的沒食子酸，將其溶解并定容至100mL，搖勻得沒食子酸儲(chǔ)備溶液。分別移取0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL儲(chǔ)備液定容至100mL，分別移取1mL定容好的溶液，加入5 mL福林酚（10%），搖勻后分別再加入4 mL碳酸鈉（7.5%），搖勻，靜置60min，在765 nm波長下測吸光度。以吸光光度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液的濃度(ug/ml)為橫作標(biāo)，得線性回歸方程y=0.009x+0.106，R2=0.999,線性關(guān)系良好。

2.3 茶多酚含量的測定

參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[11]，取試液1 mL，加入10% 5 mL福林酚溶液搖勻，5 min后加入7.5%4 mL碳酸鈉溶液，靜置60min，在765 nm波長下測吸光度。按照下述公式計(jì)算提取率。

式中：As為樣品吸光度；Vs為提取液體積；d為稀釋倍數(shù)；Slstd為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；m為干物質(zhì)含量；ms為茶漿干物質(zhì)質(zhì)量。

2.4 提取工藝試驗(yàn)

設(shè)置不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)，觀察不同因素對(duì)提取率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[12-16]，A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）、B（提取時(shí)間）、C（提取次數(shù)）、D（料液比）為自變量，以茶多酸提取率（%）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design-Expert軟件進(jìn)行分析，并得到響應(yīng)面分析圖和方差分析表。試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken因素水平和編碼Tab.1 Box-behnken factor levels and coding

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 提取條件對(duì)茶多酚提取效果的影響

3.1.1 乙醇濃度的影響

取茶葉原漿，搖勻，精密稱取15份1 g的茶葉原漿，每三份茶漿為一組。分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液20 mL（0%，30%，50%，80%，100%）在90℃的水浴鍋中加熱提取30 min（每隔10 min充分搖勻），其中無水乙醇組采用90℃水浴回流方式提取。將加熱提取好的溶液置于離心機(jī)中5 000 r/min離心5min?？疾煲掖紳舛葘?duì)鮮茶葉中茶多酚提取效果的影響。茶多酚的提取結(jié)果見圖1，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)提高時(shí)，提取效果呈現(xiàn)上升的趨勢，但增幅趨緩，并在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%的時(shí)候到達(dá)最高。呈現(xiàn)此趨勢的原因可能為：茶多酚易溶于乙醇，在沒有極性有機(jī)溶劑的情況下浸出率比較低，當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)增加時(shí)，有利于茶多酚的進(jìn)一步浸出，但溶液里乙醇含量越來越高，也會(huì)促進(jìn)色素等親脂性成分的溶出，使得茶多酚溶出受到少量影響。故80%～100%的乙醇體積分?jǐn)?shù)較為適合。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of tea polyphenols

3.1.2 提取溫度的影響

取茶葉原漿，搖勻，精密稱取24份1 g的茶葉原漿，每三份茶漿為一組。分別加入20mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液，分別于30、40、50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中提取30min（每隔10min充分搖勻），將加熱提取好的溶液置于離心機(jī)中5 000 r/min離心5min?？疾焯崛囟葘?duì)鮮茶葉中茶多酚提取效果的影響。結(jié)果見圖2，在50～80℃時(shí)茶多酚提取效果接近，提取溫度提高到90℃有較大的提高，隨著溫度的進(jìn)一步上升，茶多酚的提取效果略有下降。溫度提高有利于溶劑分子的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)溶質(zhì)的溶出，但茶多酚性質(zhì)較為活潑，溫度過高容易被破壞，故90℃的提取溫度較為適合。

圖2 提取溫度對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of tea polyphenols

3.1.3 提取時(shí)間的影響

取茶葉原漿，搖勻，稱取15份1 g的茶葉原漿，每三份為一組，精準(zhǔn)稱定。分別加入20 mL，80%乙醇溶液，置于90℃水浴鍋中水浴加熱，分別提取15、30、45、60、90min（每隔10min充分搖勻），將加熱提取好的溶液置于離心機(jī)中5 000 r/min離心5min?？疾焯崛囟葘?duì)鮮茶葉中茶多酚提取效果的影響。由圖3可知，當(dāng)提取時(shí)間從15min延長至30min時(shí)，茶多酚的提取效果顯著上升，隨后進(jìn)入平臺(tái)期，可能的原因是所用原料為茶漿，溶劑滲透效果較好，茶多酚提取較快達(dá)到平衡狀態(tài)，從效率提升的角度，因此提取時(shí)間為以30～60min為宜。

圖3 提取時(shí)間對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of tea polyphenols

3.1.4 料液比的影響

取茶葉原漿，搖勻，稱取18份1 g的茶葉原漿，每三份為一組，精準(zhǔn)稱定。分別加入不同體積的80%乙醇溶液（10、15、20、30、40、50mL），分別置于水溫為90℃的水浴鍋中加熱提取30 min（每隔10 min充分搖勻），將加熱提取好的溶液置于離心機(jī)中5 000 r/min離心5 min?？疾炝弦罕葘?duì)鮮茶葉中茶多酚提取效果的影響。由圖4可知，料液比增加的同時(shí)，茶多酚的提取效果呈上升趨勢，其中從1∶10到1∶30時(shí)增長較快，而1∶30到1∶50進(jìn)入平緩期。這可能是溶劑的增加有利于降低濃度，促進(jìn)茶多酚的擴(kuò)散，增強(qiáng)了提取效果。因此料液比為1∶30～1∶50為宜。

圖4 料液比對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of tea polyphenols

3.1.5 提取次數(shù)的影響

取茶葉原漿，搖勻，稱取9份1 g的茶葉原漿，每三份為一組，精準(zhǔn)稱定。分別加入20mL，80%乙醇溶液，置于水溫為90℃的水浴鍋中加熱提取30min，分別提取1、2、3次（每隔10min充分搖勻），將加熱提取好的溶液置于離心機(jī)中5 000 r/min離心5 min，多次提取的試驗(yàn)組將每次離心得到的上清液混合，得最終上清液（多次提取需將清液倒出，用茶樣殘?jiān)M(jìn)行同等條件的重復(fù)提?。??？疾焯崛〈螖?shù)對(duì)鮮茶葉中茶多酚提取效果的影響。結(jié)果見圖5，提取次數(shù)的增加茶多酚提取少量提升，因此提取1～3次為宜。

圖5 提取次數(shù)對(duì)茶多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of tea polyphenols

3.2 鮮茶葉茶多酚提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化分析

響應(yīng)面試驗(yàn)共有29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)依據(jù)響應(yīng)面分析方法，進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程為：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Box-behnken design and results

式中：Y為茶多酚提取率，A為乙醇體積分?jǐn)?shù)，B為提取時(shí)間，C為提取次數(shù)，D為料液比。

從多項(xiàng)式系數(shù)可以看出，影響秋茶鮮葉中茶多酚提取率因素排序?yàn)椋篋＞A＞B＞C。

從方差分析分析表3可看出，回歸模型P＜0.01，失擬項(xiàng)P＞0.05，表明該回歸方程的擬合程度較好，誤差較小，可用于對(duì)秋茶鮮葉中茶多酚提取率進(jìn)行預(yù)測。表中僅C項(xiàng)和BC項(xiàng)因子對(duì)茶多酚提取有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中C為負(fù)顯著，其余各因素對(duì)茶多酚提取差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance results

響應(yīng)面分析法圖是特定響應(yīng)值與對(duì)應(yīng)因素構(gòu)成的一個(gè)三維空間，直觀地反應(yīng)出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，可以分析出他們的相互作用。

由圖6可知：料液比的增加，茶多酚的提取效果提升明顯；乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，茶多酚的提取效果提升明顯；隨取次數(shù)的增加茶多酚的提取效果下降比較明顯；提取時(shí)間的增加，茶多酚的提取效率隨之下降，響應(yīng)值變化較小。

圖6 響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過Design-Expert軟件分析，可以得出鮮茶葉中茶多酚提取的最佳條件為料液比1∶50、提取時(shí)間為30min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%、提取次數(shù)為1次，在此條件下，茶多酚的提取率可達(dá)到95.12%。按照此參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果茶多酚的提取率達(dá)到94.85%，含量為158.40 mg/g。與理論的預(yù)測值95.12%，相對(duì)誤差僅為0.27%。說明此預(yù)測模型可信度較高。

4 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度、提取次數(shù)為考察因素，采用多重響應(yīng)面法優(yōu)化茶多酚的提取工藝條件。結(jié)果表明，采用Box-Behnken法建立鮮茶葉中茶多酚提取工藝模型得率高，并能很好的預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。以茶樹修剪枝作為提取原料，深入開展茶多酚提取分離及其生物活性的研究,開發(fā)出能防治腫瘤、心血管疾病等具有醫(yī)療保健作用的藥品、食品不僅經(jīng)濟(jì)效益相當(dāng)可觀，同時(shí)也能為保障人民健康做出巨大貢獻(xiàn)。