李娜，張婧

肝細胞癌（HCC）是世界上最常見的原發(fā)性肝癌，也是癌癥相關死亡的第三大原因，丙型肝炎病毒（HCV）感染是HCC發(fā)展的主要危險因素之一［1-4］。盡管近年來在HCV的診斷和治療方面取得了進展，但HCV相關的HCC仍然是嚴重的終末期后果。HCC治療結果的好壞有很大一部分原因取決于診斷時的分期，患者的早期治療可以大大提高其預期壽命和降低死亡率。雖然甲胎蛋白是篩查HCC最廣泛使用的標志物，但其敏感性相對較低［5］。因此，迫切需要新的腫瘤標志物來補充甲胎蛋白，以區(qū)分早期HCC患者和高危人群。

長非編碼RNA（lncRNAs）是一類長度超過200個核苷酸且不能編碼蛋白質的RNA轉錄本，其中一些被證明具有調節(jié)細胞分化和增殖的潛在功能。越來越多研究表明，lncRNAs在多種癌癥中有調節(jié)生物學功能，是一種潛在的診斷/預后標志物和治療靶點［6-8］。最近有報道稱，由轉化生長因子β（TGF-β）激活的lncRNA（lncRNA-ATB）的表達與包括胃癌和結直腸癌在內的幾種類型的人類癌癥的臨床特征和預后相關［9-10］。但其在HCV相關性HCC患者中的表達及其臨床意義卻未曾被報道過。

基于此，本研究擬通過觀察HCV相關性HCC患者血清中l(wèi)ncRNA-ATB的表達水平，分析其與患者臨床病理特征的相關性及其在患者早期診斷中的價值，以期為HCV相關性HCC患者的早期診斷提供新的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年6月至2021年6月在空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院門診就診的HCV感染患者89例為研究對象，其中單純慢性HCV（CH）患者28例，HCV相關肝硬化（LC）患者31例，HCV相關HCC患者30例。CH組患者中，男20例，女8例，年齡41～68歲，平均年齡（52.37±11.44）歲；LC組患者中，男21例，女10例，年齡43～70歲，平均年齡（53.82±10.92）歲；HCC組患者中，男20例，女10例，年齡42～71歲，平均年齡（53.17±9.87）歲。另選取30例同期的健康體檢志愿者作為對照組，男19例，女11例，年齡41～70歲，平均年齡（52.84±10.96）歲。各組受試者在性別、年齡等方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究屬于回顧性研究，經空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準同意。

納入標準：①所有患者血清HCV抗體均為陽性，血清HCV-RNA拷貝數(shù)均高于1000拷貝/mL；②根據(jù)超聲、CT、MRI掃描和病理檢查診斷肝硬化和肝癌；③HCV誘導的肝硬化和HCC的診斷至少由3名醫(yī)生完成，其中包括1名主任醫(yī)師和1名影像學醫(yī)生；④在過去3個月內，所有患者均未服用任何可能導致肝臟損害的藥物；⑤LC和HCC患者沒有接受肝移植。排除標準：①合并其他肝炎病毒感染的患者；②LC和HCC的主要病因不是HCV感染；③合并有嚴重的心臟病、嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、感染或其他腫瘤的患者；④孕婦或哺乳期婦女。

1.2 臨床數(shù)據(jù)和血清樣本的收集

從空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院病案管理系統(tǒng)獲取受試者的基本信息、臨床血清學指標和臨床影像學數(shù)據(jù)等。所有受試者均于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，室溫下3 000 r/min離心5 min，取上清液置于-80℃超低溫冰箱中保存。

1.3 實時聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測LncRNA-ATB表達水平

通過RT-PCR分析檢測LncRNA-ATB基因的表達。用Trizol試劑（Invitrogen，美國）從血清中分離總RNA，利用紫外分光光度計（NanoDrop 2000）測量其純度和濃度。根據(jù)反轉錄試劑盒（Takara，日本）的說明書，將總RNA反轉錄成cDNA。反應體系為：cDNA產物2μL，2×SYBR? Premix Ex Taq TM II 8μL，上下游引物各1μL，50×ROX Reference Dye 0.4μL，RNase-Free H2O 7.6μL。反應條件為：預變性95℃3 min，變性95℃5 s，退火60℃35s，延伸72℃20 s，共40個循環(huán)，以U6為對照，本研究通過2-ΔΔCT法計算相對表達量表示。LncRNA-ATB的上游引物序列為：5′-ACAAGCTGTGCAG TCTCAGG-3′，下游引物序列為：5′-CTAGGCCCAAAGACAA TGGA-3′；U6的上游引物序列為：5′-CTTCAGCCGGCACAG CT-3′，下游引物序列為：5′-CGCTAATTTGCGTTCAAACG-3′。

1.4 統(tǒng)計學方法

通過SPSS21.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料用%表示，組間比較采用χ2檢驗。運用受試者工作特征（ROC）曲線評價LncRNA-ATB在HCC診斷中的效能，ROC曲線下面積（AUC）＜0.60且P值＞0.05被認為是不可靠的。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組受試者的人口統(tǒng)計學和病理學特征比較

表1顯示了參與本研究受試者的人口統(tǒng)計學和病理學特征。各組受試者在性別、年齡、白細胞計數(shù)等方面的比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在血紅蛋白、血小板、總膽紅素、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血清堿性磷酸酶、白蛋白及甲胎蛋白等方面的比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在CH組、LC組和HCC組中，隨著肝病的進展，患者的白蛋白水平呈下降趨勢（P＜0.05），總膽紅素、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、血清堿性磷酸酶及甲胎蛋白呈上升趨勢（P＜0.05）。與CH組相比，LC組和HCC組的血紅蛋白和血小板顯著下降（P＜0.05）；但與LC組相比，HCC組的血紅蛋白和血小板無顯著變化（P＞0.05）。HCC組患者中BCLC分期為0期的有0例，A期的有2例（6.67%），B期的有22例（73.33%），C期的有5例（16.67%），D期的有1例（3.33%）；腫瘤＜3 cm的有2例（6.67%），3～5 cm的有12例（40.00%），＞5 cm的有16例（53.33%）。

表1 各組受試者的人口統(tǒng)計學和病理學特征比較

2.2 各組受試者血清LncRNA-ATB表達水平比較

與對照組（1.08±0.09）相比，CH組（0.92±0.07）血清LncRNA-ATB的表達水平無顯著變化（P＞0.05），LC組（2.08±0.21）和HCC組（3.76±0.29）血清LncRNA-ATB的表達水平顯著升高（P＜0.001）；與CH組相比，LC組和HCC組血清LncRNA-ATB的表達水平顯著升高（P＜0.001）；與LC組相比，HCC組血清LncRNA-ATB的表達水平顯著升高（P＜0.001），見圖1。

圖1 各組受試者血清LncRNA-ATB的表達水平

2.3 血清LncRNA-ATB對HCC的診斷價值

在區(qū)分HCC和LC患者時，LncRNA-ATB作為診斷HCC生物標志物的曲線下面積（AUC）為0.852（95%CI 0.749～0.954），P值＜0.01，最佳截斷值為3.155，敏感度為71.2%，特異性為96.8%，見圖2。

圖2 血清LncRNA-ATB診斷HCC的ROC曲線

3 討論

慢性丙型肝炎病毒感染通常會導致LC，嚴重時甚至會發(fā)展成HCC［11-13］。在我國，感染丙肝病毒的人數(shù)逐年增加，在高?；颊咧性缙谠\斷HCC對降低該疾病的死亡率十分重要［14］。目前，血清甲胎蛋白主要用于HCC病的臨床診斷，但其敏感性和特異性并不令人滿意。因此，尋找新的更敏感的生物標志物對早期檢測HCC是十分必要的。

LncRNA作為新型生物標志物在HCC的早期診斷中逐漸被關注。已有研究證明，LncRNA可通過多種機制參與包括染色質修飾、轉錄和轉錄后處理在內的表達調控［15-17］。近年來，有多種LncRNA 被發(fā)現(xiàn)與HCC 的進程有關。LncRNA-HULC已被發(fā)現(xiàn)可通過海綿吸附miR-377，促進HCC細胞增殖［18］。LncRNA-HEIH可通過與EZH2相互作用，促進HCC細胞的增殖和分化［19］。LncRNA-ATB位于人類第14號染色體，長度約為2.4 Kb，已被發(fā)現(xiàn)是多種惡性腫瘤進程中的關鍵調控分子［20-21］。在乳腺癌中，LncRNA-ATB已被發(fā)現(xiàn)可通過與miR-200c競爭性結合，上調ZEB1的表達，進而促進乳腺癌細胞發(fā)生曲妥珠單抗耐藥［22-23］。另外，LncRNAATB還被發(fā)現(xiàn)在胃癌、結直腸癌和腎細胞癌組織樣本中顯著高表達，是影響患者預后的獨立危險因素［9-10，24］。Yuan等［25］發(fā)現(xiàn)，LncRNA-ATB在TGF-β處理的HCC細胞中高表達，且其促進了HCC細胞上皮細胞-間充質轉化的發(fā)生。上述研究表明，LncRNA-ATB在多種腫瘤中呈高表達，且與腫瘤細胞的轉移、侵襲密切相關。因此，探討其在HCV相關性HCC患者血清中的表達，對疾病的治療具有重要意義。

本研究通過RT-PCR技術檢測LncRNA-ATB在健康對照、CH、LC及HCV相關性HCC患者血清中的表達水平，結果表明其在LC及HCV相關性HCC患者血清中的表達水平顯著升高，且隨著肝病的進展呈上升趨勢。該結果提示，LncRNA-ATB可能在HCV相關性HCC中扮演癌基因的角色，可能為HCV相關性HCC的輔助診斷提供一種潛在標志物。為進一步明確其在HCV相關性HCC中的臨床價值，我們采用ROC曲線評價血清LncRNA-ATB診斷HCV相關性HCC中的效能。結果發(fā)現(xiàn)，在區(qū)分LC和HCV相關性HCC患者時，LncRNA-ATB的曲線下面積（AUC）為0.852，大于0.6，且P＜0.001。因此我們認為，LncRNA-ATB對HCV相關性HCC具有較高的診斷效能。

綜上所述，LncRNA-ATB在HCV相關性HCC患者血清中高表達，且其可作為該病診斷的一種潛在生物標志物。