董春燕，王翠英，李日彩，田雯

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是第三大常見惡性腫瘤［1］，據(jù)中國癌癥統(tǒng)計，在過去的十年中，男性和女性CRC的發(fā)病率和死亡率均有所增加［2］。而直腸癌（rectal cancer，RC）作為CRC的主要亞型，占所有CRC相關(guān)病例的30%以上［3］。盡管外科手術(shù)、輻射治療和化療等多種治療方法在臨床上已經(jīng)取得較好療效，但RC患者的整體存活仍然較低，特別是對于腫瘤轉(zhuǎn)移或晚期階段的患者［4-5］。因此，迫切需要尋找基于特定RC分子機制標志物的新療法。近期研究發(fā)現(xiàn)，小核仁RNA宿主基因25（small nucleolar RNA host gene 25，SNHG25）位于17q23.3，是一個新的長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs），目前其相關(guān)報道還很少，Liu等［6］發(fā)現(xiàn)，SNHG25在卵巢癌細胞中高表達，可促進癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并抑制凋亡。微小RNA-330-3p（microRNA-330-3p，miR-330-3p）在直腸癌［7］、肝癌［8］等癌細胞中異常表達，可參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。目前，關(guān)于SNHG25、miR-330-3p在RC發(fā)展中的作用機制尚不完全清楚。有研究證實，lncRNA能夠與某些miRNA的功能序列結(jié)合，從而抑制miRNA對mRNA的調(diào)節(jié)，并間接調(diào)節(jié)mRNA的表達以影響癌癥的進展［9］。已知組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶3（SET and MYND domain containing protein 3，SMYD3）在RC組織中的表達高于癌旁正常組織，可作為RC靶向治療的新靶點［10］。本研究通過探究SNHG25在RC進展中的作用及miR-330-3p/SMYD3軸在此過程中的作用機制，以期為RC的靶向治療提供新的觀點。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人RC細胞系 SW837、SW1463 及HR8348（貨號：HTX2415C、HTX2416C、HTX2455C，深圳華拓生物細胞庫）；人正常腸黏膜上皮細胞系FHC（貨號：BNCC281458，北京北納生物公司）。

DEME培養(yǎng)基（貨號：LM-P0523，上海LMAI Bio公司）；胎牛血清（貨號：RY-F22，蘭州Royacel?公司）；青/鏈霉素（貨號：F12317中國OKA公司）；TRIzol reagent（貨號：15596018，美國Invitrogen公司）；Lipofectamine 3000 reagents（貨號：L3000008，美國Invitrogen公司）；ReverTra Ace qPCR RT Kit（貨號：FSQ-101，日本Takara公司）；THUNDERBIRD SYBR？qPCR Mix（貨號：QPS-201，日本Takara公司；Firefly&Renilla雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：AC19L022，上海李記生物公司）；基質(zhì)膠（貨號：356234，美國BD公司）；Transwell小室（貨號：3422，美國Corning公司）。實驗中所涉及的引物（上海生工生物工程有限公司）；沉默SNHG25-1/2/3表達載體（sh-SNHG25-1/2/3）及其陰性對照（sh-NC）、敲低SMYD3表達（si-SMYD3）、過表達SMYD3載體（pcDNASMYD3）、miR-330-3p模擬物（miR-330-3p mimics）與抑制物（miR-330-3p inhibitor）及其陰性對照（miR-NC）（上海雅吉生物公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

人RC細胞系（SW837、SW1463及HR8348）和人正常腸黏膜上皮細胞系（FHC）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，DEME培養(yǎng)基補充添加10%胎牛血清和100 U/mL的青/鏈霉素為細胞培養(yǎng)液，每2～3天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)細胞融合度達到90%時，進行傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染與分組

對數(shù)期生長的HR8348細胞用于轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，1×106個/mL細胞在2 mL培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，直至融合度達到90%。將細胞依次分為NC組（不作任何處理）、miR-330-3p mimics組（轉(zhuǎn)染miR-330-3p模擬物）、miR-330-3p inhibitor組（轉(zhuǎn)染 miR-330-3p抑制物）、sh-SNHG25-1+miR-330-3p inhibitor組（轉(zhuǎn)染sh-SNHG25-1+miR-330-3p抑制物）；NC組（不作任何處理）、SMYD3組（轉(zhuǎn)染pcDNA-SMYD3）、si-SMYD3（轉(zhuǎn)染si-SMYD3）、SMYD3+miR-330-3p mimics（轉(zhuǎn)染pcDNA-SMYD3+miR-330-3p模擬物）。參照Lipofectamine 3000 reagents說明書轉(zhuǎn)染48 h。

1.4 Real-Time PCR檢測基因表達

TRIzol法提取上述方法培養(yǎng)的各個RC細胞系以及各組轉(zhuǎn)染的HR8348細胞的總RNA，使用ND-2000 spectrophotometer檢測RNA濃度，通過ReverTra Ace qPCR RT試劑盒形成cDNA，根據(jù)THUNDERBIRD SYBR？qPCR Mix說明書設(shè)計體系后進行Real-Time PCR檢測每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即CT（Cyclethreshold）值。PCR程序為94℃2 min，30個循環(huán)（94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s）。用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達水平。其中，ΔCT=CT（目的基因）-CT（內(nèi)參基因），ΔΔCT=ΔCT（實驗組）-ΔCT（對照組）。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 沉默SNHG25細胞系的建立

對于下調(diào)SNHG25表達，通過使用慢病毒載體編碼的空載體（sh-NC）與靶向SNHG25的shRNA（sh-SNHG25-1/2/3）分別轉(zhuǎn)染HR8348細胞（相應(yīng)為sh-NC組及sh-SNHG25-1/2/3組），使用0.2 mg/mL嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細胞。通過Real-Time PCR檢測SNHG25沉默效率。

1.6 Transwell實驗

對于侵襲實驗，使用涂有基質(zhì)膠的Transwell小室進行測定。取各組處于對數(shù)期細胞，使用無血清培養(yǎng)基將其制成細胞密度為4×104個/mL的懸浮液，吸取200μL添加至無血清的Transwell小室上室中，向下室中添加600μL含血清的培養(yǎng)基，在37℃孵育24 h后，使用甲醇固定細胞，使用結(jié)晶紫對下層細胞染色，后在顯微鏡中觀察。

對于遷移實驗，則不需要添加基質(zhì)膠，其余方法同上。

1.7 雙熒光素酶實驗

將含有miR-330-3p結(jié)合位點的SNHG25或SMYD3的野生型或突變型片段分別插入到pmirGLO載體中，分別稱為SNHG25-WT/MUT或SMYD3-WT/MUT，隨后將其與miR-330-3p mimics或miR-NC共同轉(zhuǎn)染HR8348細胞。通過熒光素酶報告系統(tǒng)評估相對熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS25.0分析進行統(tǒng)計學(xué)分析，不同RC細胞系中SNHG25表達水平，HR8348細胞中SNHG25、miR-330-3p、SMYD3表達水平、熒光素酶活性、遷移和侵襲細胞數(shù)量以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG25在不同RC細胞中的表達

為探究SNHG25在RC發(fā)展過程中所扮演的角色，本研究通過檢測 SNHG25在RC細胞（SW837、SW1463 及HR8348）和人正常腸黏膜上皮細胞系（FHC）中的表達發(fā)現(xiàn)，SNHG25在RC細胞中的表達顯著高于FHC細胞（P＜0.05），且在HR8348細胞中其表達明顯高于其他RC細胞系（P＜0.05），見表2，因此選擇HR8348細胞進行后續(xù)實驗。

表2 SNHG25在不同RC細胞中的表達（，n=4）

表2 SNHG25在不同RC細胞中的表達（，n=4）

注：與FHC比較，a P＜0.05；與SW837比較，b P＜0.05；與SW1463比較，c P＜0.05

2.2 SNHG25在RC細胞中的沉默效率驗證

為進一步驗證SNHG25在RC細胞中的生物學(xué)功能，本研究通過轉(zhuǎn)染靶向SNHG25的shRNA（sh-SNHG25-1/2/3）下調(diào)SNHG25在HR8348細胞中的表達。結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-SNHG25-1/2/3組SNHG2的表達顯著下調(diào)（P＜0.05），見表3。鑒于sh-SNHG25-1沉默效率最高，將選擇sh-SNHG25-1進行后續(xù)研究。

表3 SNHG25在RC細胞中的沉默效率（，n=4）

表3 SNHG25在RC細胞中的沉默效率（，n=4）

注：與sh-NC組比較，a P＜0.05；與sh-SNHG25-1組比較，b P＜0.05；與sh-SNHG25-2組比較，c P＜0.05

2.3 沉默SNHG25對RC細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與sh-NC組相比，sh-SNHG25-1組RC細胞遷移和侵襲細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），見圖1、表4。

表4 沉默SNHG25對RC細胞遷移和侵襲的影響（，n=4）

表4 沉默SNHG25對RC細胞遷移和侵襲的影響（，n=4）

圖1 沉默SNHG25對RC細胞遷移和侵襲的影響

2.4 SNHG25與miR-330-3p的靶向調(diào)控關(guān)系

通過starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，SNHG25與miR-330-3p存在相互結(jié)合位點。通過雙熒光素酶實驗發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p mimics可顯著降低SNHG25-WT的熒光素酶活性（P＜0.05）。且通過Real-Time PCR驗證發(fā)現(xiàn)：miR-330-3p在sh-SNHG25-1組HR8348細胞中的表達顯著低于sh-NC組（0.23±0.01比1.00±0.02，P＜0.05），見圖2、表5。

表5 雙熒光素酶的實驗結(jié)果（，n=4）

表5 雙熒光素酶的實驗結(jié)果（，n=4）

圖2 SNHG25與miR-330-3p靶位點結(jié)合的預(yù)測結(jié)果

2.5 miR-330-3p對RC細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-330-3p mimics組細胞中miR-330-3p表達增高，而遷移細胞數(shù)量和侵襲細胞數(shù)量都明顯減少（P＜0.05）；miR-330-3p inhibitor組miR-330-3p表達降低，而遷移細胞數(shù)量和侵襲細胞數(shù)量都明顯增多（P＜0.05）。與miR-330-3p inhibitor組相比，sh-SNHG25-1+miR-330-3p inhibitor組細胞中miR-330-3p表達顯著增高，遷移細胞數(shù)量和侵襲細胞數(shù)量都明顯減少（P＜0.05），見圖3、表6。

表6 miR-330-3p對RC細胞遷移和侵襲的影響（，n=4）

表6 miR-330-3p對RC細胞遷移和侵襲的影響（，n=4）

注：與NC組比較，a P＜0.05；與miR-330-3p mimics組比較，b P＜0.05；與miR-330-3p inhibitor組比較，c P＜0.05

圖3 miR-330-3p對RC細胞遷移和侵襲的影響

2.6 miR-330-3p與SMYD3的靶向調(diào)控關(guān)系

通過Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，SMYD3與miR-330-3p存在相互結(jié)合位點。通過雙熒光素酶實驗驗證發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p mimics可顯著降低SMYD3-WT的熒光素酶活性（P＜0.05）。且通過Real-Time PCR驗證發(fā)現(xiàn)：SMYD3在miR-330-3p mimics組HR8348細胞中的表達顯著低于miRNC組（0.35±0.03比1.04±0.03，P＜0.05），見圖4、表7。

表7 雙熒光素酶實驗結(jié)果（，n=4）

表7 雙熒光素酶實驗結(jié)果（，n=4）

圖4 SMYD3與miR-330-3p靶位點結(jié)合的預(yù)測結(jié)果

2.7 SMYD3對RC細胞遷移和侵襲的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與NC組相比，SMYD3組中SMYD3 mRNA表達、遷移細胞數(shù)量和侵襲細胞數(shù)量均明顯增多（P＜0.05）；si-SMYD3組SMYD3 mRNA表達、遷移細胞數(shù)量和侵襲細胞數(shù)量均明顯減少（P＜0.05）。與SMYD3組相比，SMYD3+miR-330-3p mimics組細胞中SMYD3 mRNA表達、遷移細胞數(shù)量和侵襲細胞數(shù)量均明顯減少（P＜0.05），見圖5、表8。

表8 SMYD3對RC細胞遷移和侵襲的影響（，n=4）

表8 SMYD3對RC細胞遷移和侵襲的影響（，n=4）

注：與NC組比較，a P＜0.05；與SMYD3組比較，b P＜0.05；與si-SMYD3組比較，c P＜0.05

3 討論

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是轉(zhuǎn)錄本超過200 bp的非編碼RNA［11］。LncRNA可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和穩(wěn)定性，影響細胞增殖、分化和存活，并在各種疾病中發(fā)揮作用［12］。在癌癥中，lncRNAs可用作抑癌或促癌基因參與調(diào)控癌癥信號通路［13-15］，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG家族在多個癌癥中均有涉及，如：SNHG15可通過介導(dǎo)肝細胞癌中的miR-490-3p/組蛋白去乙?；?軸促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG25在RC細胞系中的表達顯著高于人正常腸黏膜上皮細胞系（FHC），且在HR8348細胞中表達最高，提示，SNHG25可能參與RC的發(fā)生發(fā)展過程。為進一步探究SNHG25在RC發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過轉(zhuǎn)染靶向SNHG25的shRNA下調(diào)SNHG25表達發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SNHG25表達，可明顯抑制RC細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)量，以上結(jié)果表明，SNHG25參與RC的遷移和侵襲。

miRNA被鑒定為一類內(nèi)源性非編碼RNA，其長度約為22個核苷酸，其可通過抑制mRNA翻譯來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達［17］。如前人所述，miRNA廣泛參與調(diào)控疾病的關(guān)鍵生物過程，如細胞增殖、分化等［18］，還可作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［19］。miR-330-3p是miR-330的主要亞型之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均具有重要作用，如：Jin等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p通過靶向絲裂原活化蛋白激酶激酶1抑制肝癌細胞的遷移；黃開禹等［21］發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p可通過靶向抑制RUVBL1表達，進而促進CRC細胞凋亡；Huang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HLA-F-AS1可通過海綿下調(diào)miR-330-3p表達，促進PFN1表達，進而促進CRC細胞增殖、侵襲和遷移，抑制凋亡。本研究利用starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-330-3p與SNHG25存在靶標結(jié)合位點，通過雙熒光素酶驗證二者的靶向關(guān)系發(fā)現(xiàn)，二者存在負靶向調(diào)控。隨后，將miR-330-3p模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染HR8348細胞發(fā)現(xiàn)，miR-330-3p表達上調(diào)可顯著抑制細胞遷移及侵襲能力，miR-330-3p表達下調(diào)可明顯促進細胞遷移及侵襲能力，與前人研究結(jié)果類似，說明miR-330-3p在RC中為抑癌基因。同時下調(diào)miR-330-3p和SNHG25表達可明顯改善下調(diào)miR-330-3p表達對RC細胞侵襲和遷移能力的促進作用。以上結(jié)果說明，SNHG25可能通過負靶向調(diào)控miR-330-3p表達進而影響RC細胞侵襲和遷移。

近年來，SMYD3在腫瘤中的作用被廣泛研究，SMYD3在胃癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤組織中高表達，且SMYD3高表達患者的預(yù)后也相對較差［10］。有研究顯示，SMYD3是CRC發(fā)生不可缺少的基因［23］，且抑制SMYD3表達可通過抑制癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進而抑制腫瘤細胞的生長及侵襲［24-25］。李冰濤等［10］已證明，SMYD3參與RC的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于其機制還未可知。本研究通過利用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)SMYD3與miR-330-3p存在靶標結(jié)合位點，通過雙熒光素酶報告實驗驗證，二者存在負靶向關(guān)系。通過HR8348細胞過表達與沉默SMYD3發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SMYD3表達可顯著促進細胞遷移及侵襲能力，下調(diào)其表達可顯著抑制細胞遷移及侵襲能力，與前人研究結(jié)果相同，說明SMYD3是RC中的促癌基因。通過進一步驗證發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)SMYD3表達的同時上調(diào)miR-330-3p表達可明顯減弱上調(diào)SMYD3表達對細胞遷移及侵襲能力的促進作用，說明上調(diào)miR-330-3p可能通過負靶向調(diào)控SMYD3表達進而影響RC細胞侵襲和遷移。

綜上所述，SNHG25在RC細胞中高表達，其可能通過靶向調(diào)控miR-330-3p/SMYD3軸調(diào)節(jié)RC細胞遷移及侵襲。SNHG25/miR-330-3p/SMYD3通路的發(fā)現(xiàn)可能為RC患者提供更有效的臨床治療策略，為后續(xù)研究lncRNA/miRNA/mRNA通路提供參考。但本研究也存在一定的不足：未在動物模型體內(nèi)驗證SNHG25及miR-330-3p/SMYD3對RC的影響；未涉及多個RC細胞系驗證，實驗結(jié)果具有一定的局限性；未深入探究SNHG25對其他生物學(xué)過程的影響，如增殖，凋亡等，后續(xù)將針對以上問題進行深入的探討。