劉 洋，劉高祥，丁子俊，司宇佳，盛路寧，方 舟，趙維萍，蔡 華

單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個體，經(jīng)染色體加倍后，在一個世代中即可獲得純合的二倍體群體，再根據(jù)育種目標(biāo)從群體中選擇優(yōu)良的純系，其后代不會發(fā)生性狀分離，表型整齊一致。與常規(guī)育種相比，單倍體育種能夠極大程度地縮短育種年限，在小麥、水稻、煙草等作物育種中得到了廣泛應(yīng)用[1]。在小麥單倍體育種過程中，獲得單倍體最常見的途徑是球莖大麥法、花藥培養(yǎng)法和玉米雜交法。

早在1984年，Zenkteler就首次報道了以小麥做母本玉米做父本進行遠緣雜交獲得球形胚的研究[2]。隨后，Laurie等初次從細胞學(xué)角度證明小麥與玉米雜交所得是雜種胚，研究發(fā)現(xiàn)遠緣雜交后來自玉米花粉的染色體在最初的三次細胞分裂中會被逐漸地完全排除掉，最后只剩下小麥母本的21條染色體，即產(chǎn)生了小麥單倍體胚[3]。自1988年Laurie等利用小穗培養(yǎng)法首次獲得小麥與玉米遠緣雜交產(chǎn)生的單倍體植株后[4]，國內(nèi)外許多學(xué)者均進行了有關(guān)理論研究和技術(shù)改良，并應(yīng)用于小麥育種實踐中[5-6]。利用小麥×玉米誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的技術(shù)具有單倍體誘導(dǎo)效率高、對小麥基因型無嚴(yán)格的選擇性、不產(chǎn)生白化苗、誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體遺傳穩(wěn)定性高和雜交結(jié)實率較高等優(yōu)點[7-10]。本課題組前期以5E008 ×寧麥9號的F1與玉米遠緣雜交誘導(dǎo)小麥單倍體，再經(jīng)染色體加倍獲得了DH系，并從中選育出了小麥新品種蘇隆128[11]。陳新民等也利用小麥與玉米雜交創(chuàng)制小麥DH群體技術(shù)選育出了小麥新品種中麥533[12]。

本研究將矮抗58×蘇隆128的F1代小麥植株在開花時與甜玉米雜交，產(chǎn)生單倍體植株，再將單倍體植株進行染色體加倍獲得可以穩(wěn)定遺傳的純合群體，并希望可以獲得高抗倒伏，飽滿度好，成穗率高，商品性好且高抗赤霉病的遺傳群體。

1 材料與方法

1.1 親本材料

以高抗倒伏、抗凍性強、分蘗多的半冬性中熟品種矮抗58為母本，以抗赤霉病、籽粒優(yōu)良的春性品種蘇隆128為父本進行雜交得到F1代。再以F1為母本，以甜玉米(購自滁州市當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場)為父本進行遠緣雜交。

1.2 小麥種子人工春化及分期播種甜玉米

由于F1的母本矮抗58是一個半冬性品種，其需要低溫春化才能正常開花結(jié)實。所以為了保證小麥與玉米花期相遇，并保證F1代小麥正常開花結(jié)實，于2016年7月先對F1代小麥進行人工春化(4℃低溫處理3周左右)，然后從8月起分期播種甜玉米(每周播種1次，連續(xù)播種6次)，小麥材料于8月初春化完成后移栽至人工氣候室。

1.3 小麥去雄及授粉

2016年9月～11月進行人工去雄與授粉。在小麥開花前2 d～3 d進行人工去雄并套袋隔離；去雄后3 d～5 d內(nèi)及時授予新鮮甜玉米花粉，甜玉米花粉量充足時可采用“滾粉”法授粉[13]，授粉后仍然需要進行套袋隔離。

1.4 割穗離體培養(yǎng)及田間培養(yǎng)

割穗離體培養(yǎng)法：先按照表1配制混合培養(yǎng)液5 L。在授粉24 h后，齊根部將雜交后的麥穗剪下，將穗的根部插入配制好的混合培養(yǎng)液中，于組培室培養(yǎng)14 d(白天溫度 22℃～23 ℃、夜間 16℃～17 ℃、濕度70 %左右、光照為自然散射光)，每天更換培養(yǎng)液1次[14]。

表1 溶質(zhì)濃度

田間常規(guī)雜交法：授粉5 h后在雜交穗最上部莖節(jié)內(nèi)注射約0.5 mL的100 mg/L 2,4-D溶液，24 h后重復(fù)注射一次。在授粉后第12d～16d每天采取部分雜交穗[15]。

1.5 胚拯救與幼苗培養(yǎng)

在離體培養(yǎng)(或田間自然生長)14 d后開始進行胚拯救，具體過程如下：①每個膨大的子房用75%的乙醇進行消毒30 s，再用0.1%氯化汞溶液表面滅菌15 min，最后用無菌水沖洗3次；②在潔凈工作臺內(nèi)的解剖鏡下進行剝胚，將獲得的雜交幼胚接種到1/2 MS培養(yǎng)基中。

將接種的幼胚置于4℃冰箱中冷藏2 d，然后移到25℃組培室中遮光培養(yǎng)12d左右，待單倍體幼胚分化出根和莖以后，按每天光照12 h進行培養(yǎng)，直到幼苗長至5cm～8 cm高后移栽至花盆內(nèi)，并噴灑生長素吲哚乙酸和多效唑[15]。

1.6 單倍體苗的染色體人工加倍

單倍體苗達3個以上分蘗節(jié)時，從花盆中取出幼苗，洗凈根部，剪去須根，置25 ℃的20 mL/L二甲基亞砜+ 0.05 %的秋水仙素溶液中處理7 h并持續(xù)給O2。然后用流動水沖洗12 h后，移栽至田間土壤中。在抽穗后開花前對所有植株逐穗套袋，并觀察植株結(jié)實情況，最終收獲加倍單倍體(Double Haploid，簡稱DH)種子。

2 結(jié)果與分析

2.1 花期調(diào)節(jié)

為了保證甜玉米與F1代小麥能夠花期相遇，本試驗分期種植甜玉米，每隔一周種植一批，總共種植6期。表2記錄了花期調(diào)控的結(jié)果，結(jié)果表明：8月初人工春化完成后移栽入田間的小麥可與某幾個播種期的甜玉米的花期相遇；8月2日播種的甜玉米較8月4日移栽入田間的小麥晚開花4天；10月份的持續(xù)陰雨天氣導(dǎo)致了玉米開花時間推遲。

表2 花期調(diào)節(jié)試驗統(tǒng)計表

2.2 割穗離體培養(yǎng)與田間自然生長條件下子房的比較

從圖1可以看出，割穗離體培養(yǎng)1 d時雜交后的小麥子房就已開始發(fā)育，離體培養(yǎng)14 d后小麥子房膨大至可進行胚拯救的狀態(tài)；而田間自然生長14 d后雜交子房膨大情況仍不甚理想，且多數(shù)被霉菌感染，這可能是由于套袋引起子房周圍濕度過高導(dǎo)致霉菌生長。從小麥穗取下雜交子房后可以看出無效子房、雜交子房與自花授粉子房有明顯差異，無效子房癟小，雜交子房較飽滿，自花授粉子房非常飽滿(圖1)。

(a)離體培養(yǎng)1 d的子房；(b)離體培養(yǎng)14 d的子房；(c)田間自然生長14 d的子房；(d)上：無效子房；中：雜交子房；下：自花授粉子房

3.3 單倍體胚與自花授粉胚的比較

小麥與玉米遠緣雜交產(chǎn)生的單倍體子房內(nèi)會出現(xiàn)胚乳敗亡，僅剩單倍體胚的現(xiàn)象[3]。本試驗雜交子房內(nèi)就表現(xiàn)出無胚乳，且僅有較小的胚(圖2)。而正常情況下，小麥自花授粉的子房既有胚又有胚乳，且胚較大(圖2)。

(a)無胚乳的單倍體胚；(b)有胚乳的自花授粉的胚

3.4 單倍體幼苗與自花授粉幼苗的比較

單倍體幼苗一般比較纖弱，生長緩慢，高度不育，無法形成種子，本試驗研究與其一致。如圖3所示，遠緣雜交產(chǎn)生的單倍體幼苗較自花授粉幼苗生長緩慢且弱小，相同培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)30d時，單倍體幼苗也僅長出一片葉，而自花授粉幼苗生已長成5～6片葉(圖3)。

(a)光照培養(yǎng)2 d的單倍體胚(箭頭所示);(b)光照培養(yǎng)30 d的單倍體幼苗;(c)光照培養(yǎng)2 d的自花授粉幼苗;(d)光照培養(yǎng)30 d的自花授粉幼苗

3.5 得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率

雜交穗割穗離體培養(yǎng)和自然生長條件下的得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率結(jié)果如表3所示。表3結(jié)果表明，割穗離體培養(yǎng)處理在得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率上均要明顯高于自然條件下生長的雜交穗，前者的平均得果率比后者高出8.5%，并且后者沒有得到單倍體胚和幼苗，這就表明室內(nèi)割穗離體培養(yǎng)的條件更加有利于單倍體胚的形成和生長發(fā)育。最終本試驗通過割穗離體培養(yǎng)法獲得156株雙單倍體植株(圖4)。通過統(tǒng)計計算得出總得果率=80.56%,總得胚率=3.28%，總胚成苗率=7.50%，總加倍成功率=66.67%。

表3 得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率統(tǒng)計表

圖4 雙單倍體遺傳群體

3 討論

在正常的栽培條件下，小麥和玉米的花期總是不遇的。小麥一般在冬季播種，次年春季開花，而冬春季節(jié)種植的玉米一般植株比較矮小，花粉量少，育性也較差；玉米一般在夏秋季播種、開花，此時種植小麥會因不能春化而無法抽穗開花，即無法進行授粉。胡冬梅為使小麥與玉米花期相遇，采用玉米溫床育苗培養(yǎng)、大田移栽，小麥分期播種的方法來調(diào)節(jié)花期[16]。本試驗采用的則是人工春化小麥然后移栽和分期播種玉米的方法來使小麥與玉米花期相遇。因此，分期播種并配合適當(dāng)?shù)拇胧┦巧a(chǎn)上調(diào)節(jié)花期常用的方法。

小麥與玉米遠緣雜交后雜交穗的培養(yǎng)一般有兩種方法：一種是割穗離體培養(yǎng)法，另一種是田間自然生長培養(yǎng)法。顧堅等在研究兩種方法下的單倍體胚誘導(dǎo)效果時發(fā)現(xiàn)割穗離體培養(yǎng)處理得胚率要明顯高于田間自然生長條件下的雜交穗，前者是后者的3.29倍；前者的穎殼結(jié)實率也比后者高出20%，且離體培養(yǎng)的穎果要比自然生長條件下的穎果飽滿；另外，離體培養(yǎng)形成的單倍體胚要比自然生長形成的單倍體胚大，這都表明室內(nèi)割穗離體培養(yǎng)更有利于單倍體胚的形成和生長發(fā)育[14]。本試驗同樣采用了上述兩種方法，結(jié)果與之類似，雜交后14d割穗離體培養(yǎng)子房的膨大程度要高于田間自然生長，并且割穗離體培養(yǎng)處理在得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率上均要明顯高于自然條件下生長的雜交穗，最后只在離體培養(yǎng)法中得到了單倍體胚和幼苗。離體培養(yǎng)法比田間自然生長法得胚率高，可能與室外溫度變幅較大，而室內(nèi)溫度變幅較小、濕度較穩(wěn)定有關(guān)。而且田間自然生長條件下需要對雜交穗套袋，袋內(nèi)濕度過高時會導(dǎo)致子房多被霉菌包圍，這也會降低得胚率。本試驗田間自然生長條件下未剝出單倍體胚，可能就是由于田間生長時長期套袋且不通風(fēng)使得麥穗濕度過大，麥穗大部分滋生霉菌，子房未正常發(fā)育所致。

培養(yǎng)液中的成分也是影響雜交穗離體培養(yǎng)效果的一個重要因素。本試驗中離體培養(yǎng)A、B、C和D四個批次的平均得果率為僅為42.91%，比田間自然生長條件下的平均得果率低23.36%，后期經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)這四個批次培養(yǎng)液所用的亞硫酸過期失效，換掉失效的亞硫酸后，離體培養(yǎng)H、I等批次的得果率和得胚率明顯上升。所以亞硫酸的失效可能是導(dǎo)致得果率較低且幼胚發(fā)育不完全、幼胚較小、大部分未正常發(fā)育為幼苗的原因，但還需要進一步驗證。

利用小麥與玉米進行遠緣雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，在自然條件下其染色體不能加倍，必須經(jīng)過人工染色體加倍后才能獲得育種上可利用的純合雙單倍體小麥，從而穩(wěn)定地遺傳下去。通常利用秋水仙素對小麥的根部進行處理的方法來誘導(dǎo)染色體加倍，但秋水仙素使用濃度過高時會產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致爛根現(xiàn)象，進而會降低植株的成活率。陳新民等用濃度分別為500mg/L、750mg/L和1000mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)處理已有2～3個分蘗的單倍體小麥植株5h，并且給予光照、溫度控制在23℃～25℃，后期測得三個濃度下的加倍率分別為89.6%、76.05%和73.3%，該研究還認(rèn)為培育壯苗是提高染色體加倍效率的重要因素[17]。本課題組前期研究表明，用750mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)處理單倍體小麥苗5h的加倍效果最好(86.4%)，并且處理時持續(xù)供應(yīng)O2能夠提高加倍率及加倍處理效率[18]。本試驗就是用750mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)并持續(xù)通O27h處理離體培養(yǎng)獲得的200多棵單倍體小麥植株，最終獲得156棵染色體成功加倍的小麥雙單倍體植株。