李 琦，張達(dá)娟，張樹林，王澤斌，賈瀅暄，黃蘭英，梁鵬飛，陳 璇，龍成鳳

響應(yīng)面法優(yōu)化小新月菱形藻培養(yǎng)基

李 琦，張達(dá)娟，張樹林，王澤斌，賈瀅暄，黃蘭英，梁鵬飛，陳 璇，龍成鳳

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 / 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

【】優(yōu)化小新月菱形藻（）培養(yǎng)基，篩選其生長的最佳營養(yǎng)鹽濃度。采用響應(yīng)面法，篩選f/2培養(yǎng)基中的NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7濃度，優(yōu)化小新月菱形藻的培養(yǎng)基配方并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)?！尽扛鶕?jù)單因素試驗(yàn)篩選出小新月菱形藻相對適宜的營養(yǎng)鹽濃度：NaNO3為0.2、0.5和0.8 g/L，NaH2PO4·H2O為0.005、0.007 5和0.01 g/L，Na2SiO3為0.02、0.05和0.08 g/L，C6H8FeNO7為0.001、0.002和0.003 g/L；通過響應(yīng)面優(yōu)化，4種營養(yǎng)鹽對小新月菱形藻生長的影響強(qiáng)弱依次為：NaNO3、NaH2PO4·H2O、C6H8FeNO7、Na2SiO3，最佳濃度分別為NaNO30.5 g/L，NaH2PO4·H2O 0.007 5 g/L，Na2SiO30.05 g/L，C6H8FeNO70.002 g/L，營養(yǎng)鹽濃度過高或過低均會抑制小新月菱形藻生長；使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)該藻，藻細(xì)胞密度提高28.15%，顯著高于f/2培養(yǎng)基組的細(xì)胞密度（< 0.05）。

小新月菱形藻；營養(yǎng)鹽；藻細(xì)胞密度；響應(yīng)面法

小新月菱形藻（）不僅是海洋魚、蝦、貝類等生物的重要餌料，而且是巖藻黃素、金藻昆布糖和十二碳五烯酸（EPA）等生物活性物質(zhì)的提取基質(zhì)[1]，亦可用于改善水質(zhì)，形成良好的養(yǎng)殖水環(huán)境。夏建榮等[1]和馬若欣等[2]用單因素試驗(yàn)法篩選小新月菱形藻培養(yǎng)基氮、磷濃度，發(fā)現(xiàn)小新月菱形藻生長速率隨培養(yǎng)液中氮、磷濃度的升高而升高[2]，但隨著氮濃度的升高，藻密度先升后降，在照度為260 μmol/(m2·s)時(shí)生長速率最快[3]。李炳乾等[4]和任莉紅[5]用正交試驗(yàn)篩選小新月菱形藻生長的最適營養(yǎng)鹽濃度，發(fā)現(xiàn)影響生長的4因素先后順序?yàn)镹、Si、Fe、P[4]；在NaNO30.3 g/L、NaH2PO4·H2O 0.03 g/L、Na2SiO30.1 g/L時(shí)，藻生長最快，密度最高[5]?？梢?，營養(yǎng)鹽組成和培養(yǎng)條件對小新月菱形藻生長均有顯著影響，但研究結(jié)論不盡一致，原因是培養(yǎng)基成分種類繁多，關(guān)系錯綜復(fù)雜。單因素法僅考慮一種因素影響，缺乏因素間交互性分析。正交試驗(yàn)法雖同時(shí)考慮多種因素，但不能得出因素和響應(yīng)值間明確的函數(shù)表達(dá)式，無法求得整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和最優(yōu)值[6]。響應(yīng)面法通過不斷改變設(shè)計(jì)參數(shù)修改試驗(yàn)?zāi)Ｐ停苯油ㄟ^大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)出所要擬合的函數(shù)[7]。本研究用響應(yīng)面法優(yōu)化小新月菱形藻培養(yǎng)基，篩選其生長的最佳營養(yǎng)鹽濃度，為小新月菱形藻的高密度培養(yǎng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小新月菱形藻購自上海光語生物科技有限公司，在f/2培養(yǎng)基于光照培養(yǎng)箱（日本三洋有限公司 MLR352-PC）中進(jìn)行培養(yǎng)，鹽度29，培養(yǎng)溫度為（22±1）℃，照度為50 μmol/(m2·s)，光暗比為12 h/12 h，每天搖瓶3次，防止沉淀。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以f/2培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，采用單因素試驗(yàn)法分別對氮、磷、硅和鐵源進(jìn)行篩選，各營養(yǎng)鹽濃度見表1，各營養(yǎng)鹽濃度梯度分別設(shè)3個(gè)平行。取對數(shù)生長期小新月菱形藻離心（5 000 r/min，5 min，4 ℃），去上清液，將藻泥加入經(jīng)高溫滅菌的上述各培養(yǎng)基，每個(gè)處理組中藻細(xì)胞初始密度均為1×106mL-1。試驗(yàn)進(jìn)行14 d，培養(yǎng)條件同1.1，8 d時(shí)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對藻細(xì)胞計(jì)數(shù)。

表1 營養(yǎng)鹽單因素濃度水平

1.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)法篩選出NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、C6H8FeNO7的適宜濃度，以此為基礎(chǔ)分別設(shè)置3個(gè)濃度水平，以藻密度（）為響應(yīng)值，用Design Expert 11.0 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)[7-10]，每組設(shè)置3個(gè)平行，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)（中心點(diǎn)重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差），以獲取最佳營養(yǎng)鹽濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Design-Expert 11.0繪制等高線和響應(yīng)曲面圖。用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Original繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)鹽單因素試驗(yàn)

單一營養(yǎng)鹽對小新月菱形藻生長的影響如圖1所示。在培養(yǎng)8 d時(shí)，小新月菱形藻在NaNO3為0.50 g/L，NaH2PO4·H2O為0.005和0.010 g/L，Na2SiO3為0.05 g/L，C6H8FeNO7為0.001和0.002 g/L時(shí)密度最大，分別為5.25×106、5.26×106、8.96×106、7.1×106mL-1，均顯著高于其他處理組（< 0.05），根據(jù)初步結(jié)果選擇0.20、0.50和0.80 g/L的NaNO3，0.005 0、0.007 5和0.010 0 g/L的NaH2PO4·H2O，0.02、0.05和0.08 g/L的Na2SiO3及0.001、0.002和0.003 g/L的C6H8FeNO7進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)

因素和水平設(shè)計(jì)見表2，響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果見表3，經(jīng)擬合，得到細(xì)胞密度（）與NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、C6H8FeNO7質(zhì)量濃度（、、、）的回歸方程為：

= 865.6 + 133.08 ×+ 57.33 ×- 20.25 ×+ 26.67 ×+ 43 ×- 6 ×+ 26.75 ×+ 47.5 ×+ 28 ×+ 72.75 ×- 152.18 ×2- 135.05 ×2- 98.92 ×2- 114.55 ×2。

不同字母表示組間差異顯著（P < 0.05）

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平

表3 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果

上述模型的方差分析結(jié)果如表4所示。該回歸方程的值為80.45，< 0.000 1，模型極顯著；經(jīng)檢驗(yàn)，、、、、、、、、、2、2、2和2項(xiàng)對細(xì)胞密度影響顯著（< 0.05）；擬合曲線方差分析結(jié)果中，決定系數(shù)2＝0.987 7，矯正系數(shù)Adj2＝0.975 4；該模型中精密度值為26.595 7，當(dāng)精密度值大于4時(shí)可用。圖2為殘差的正態(tài)概率、預(yù)測值與試驗(yàn)實(shí)際值分布，可見各散點(diǎn)均靠近同一條直線。綜上，該模型中細(xì)胞密度對NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、C6H8FeNO7質(zhì)量濃度的擬合性較佳。

NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3、C6H8FeNO7間交互作用的響應(yīng)面分析見圖3(a-e)，結(jié)合表4可見< 0.05，等高線明顯呈橢圓形且較密集，說明各因素間交互作用強(qiáng)，對密度影響極顯著；隨著濃度的增加，曲面呈先升后降趨勢，在水平為0時(shí)，藻密度最大。從圖3(f)可見等高線呈橢圓特征，說明NaNO3和Na2SiO3有交互作用，表4二因素＞0.1，密度影響不顯著，交互作用較弱。

表4 回歸模型方差分析

說明Notes：*,< 0.05 ；**，< 0.01。

圖2 模型的殘差正態(tài)概率、殘差與預(yù)測值分布以及實(shí)驗(yàn)預(yù)測值與實(shí)測值分布

R1,藻細(xì)胞密度/(104 mL-1); A, ρ(NaNO3)/(g/L); B, ρ(NaH2PO4·H2O)/(g/L); C,ρ(Na2SiO3)/(g/L); D, ρ(C6H8FeNO7)/(g/L)

圖3 （續(xù)）

3 驗(yàn)證

3.1 最佳營養(yǎng)鹽濃度

通過響應(yīng)面軟件Design-Expert 11.0對數(shù)據(jù)進(jìn)一步的擬合分析，得到NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7的最佳質(zhì)量濃度分別為0.50、0.0075、0.05、0.002 g/L，藻細(xì)胞密度達(dá)到最大值。

3.2 結(jié)果驗(yàn)證

用優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)小新月菱形藻12 d時(shí)，藻密度最大，為15.93×106mL-1，顯著高于對照組的12.43×106mL-1，藻細(xì)胞密度提高28.15%（圖4）。

*，組間差異顯著Significant difference between groups (P < 0.05)

4 討論

本研究方差分析可見，4因素對小新月菱形藻均有極顯著影響；從值可知，影響密度的因素強(qiáng)弱順序?yàn)镹、P、Fe、Si。李炳乾等[4]和任莉紅[5]也認(rèn)為N的影響最為顯著，明顯強(qiáng)于P、Fe和Si對小新月菱形藻生長的影響，起主導(dǎo)作用。

本研究先用單因素法篩選4種營養(yǎng)鹽從低到高最適濃度范圍，再采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化；李炳乾等[4]采用正交試驗(yàn)法對N、P、Si、Fe的濃度進(jìn)行優(yōu)化，直接設(shè)計(jì)試驗(yàn)濃度；王青巖等[3]采用單因素試驗(yàn)法對N、P、Si進(jìn)行濃度篩選，其余等同f/2培養(yǎng)基。本研究得出的各營養(yǎng)鹽最佳質(zhì)量濃度分別為NaNO30.50 g/L、NaH2PO4·H2O 0.007 5 g/L、Na2SiO30.05 g/L、C6H8FeNO70.002 g/L，李炳乾等[4]得出的營養(yǎng)鹽最佳質(zhì)量濃度分別為NaNO30.3 g/L、NaH2PO4·H2O 0.015 g/L、Na2SiO30.12 g/L、C6H8FeNO70.001 575 g/L，王青巖等[3]認(rèn)為N、P、Si的新培養(yǎng)基是舊培養(yǎng)基的4、0.5和8倍，本研究中，藻細(xì)胞密度在培養(yǎng)6 d時(shí)開始呈指數(shù)增長，12 d時(shí)達(dá)到最大值15.93×106mL-1，李炳乾等[4]研究發(fā)現(xiàn)，最高細(xì)胞密度出現(xiàn)在4 ～ 5 d，最大值為9.8×106mL-1；而王青巖等[3]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞前6 d呈指數(shù)增長，在10 d時(shí)達(dá)到最大值6.5×106mL-1。本研究的藻細(xì)胞密度遠(yuǎn)大于前人研究結(jié)果，造成差異的原因可能是營養(yǎng)鹽的濃度和種類不同，藻種來源和培養(yǎng)條件、方法的不同。任莉紅[5]發(fā)現(xiàn)，NaNO3在0.3 g/L、NaH2PO4·H2O在0.03 g/L、Na2SiO3在0.1 g/L時(shí)，藻生長最快，藻密度最高，與本研究結(jié)果相近。氮可讓硅藻大量繁殖，是硅藻成熟分裂的重要元素[11]。本研究單因素試驗(yàn)表明，隨著N濃度的升高，藻細(xì)胞密度先上升后下降，表明N濃度過高或者過低均會抑制小新月菱形藻的生長。磷不僅是細(xì)胞膜的重要組成部分，還可調(diào)節(jié)酸堿平衡，對培養(yǎng)基起緩沖作用[11]。本研究表明，小新月菱形藻更適于在低濃度磷條件下生長，與李炳乾等[4]的最適磷0.015 g/L、任莉紅[5]的磷源最適質(zhì)量濃度0.02 ～ 0.03 g/L結(jié)果相近。硅是細(xì)胞壁的主要組成部分，同時(shí)參與生長代謝過程[11]。Shifrin等[12]研究發(fā)現(xiàn)，微藻在缺硅條件下1周時(shí)，細(xì)胞即停止分裂甚至死亡。本研究中，Na2SiO3質(zhì)量濃度為0.05 g/L時(shí)藻密度達(dá)到8.96×106mL-1，當(dāng)硅質(zhì)量濃度逐漸增加時(shí)，藻密度先升后降，趨勢比較緩慢，李炳乾等[4]發(fā)現(xiàn)，最適硅源質(zhì)量濃度為0.12 g/L，任莉紅[5]發(fā)現(xiàn)最適硅源質(zhì)量濃度為0.1 g/L，與本研究結(jié)果有一定偏差，表明營養(yǎng)鹽濃度及配比對藻類代謝活動和生長速率有顯著的影響[13]。鐵是藻類生長過程中不可或缺的元素，也是藻細(xì)胞中某些還原酶的組成部分，缺鐵會抑制藻的生長。本研究中，C6H8FeNO7質(zhì)量濃度為0.002 g/L時(shí)藻密度最大，與李炳乾等[4]的C6H8FeNO70.001 575 g/L結(jié)果相近。

微藻大量培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基不僅要符合藻類的自然生長特性，還要注意各種營養(yǎng)因素的最佳用量和各因素之間的平衡關(guān)系。本研究用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化小新月菱形藻培養(yǎng)基，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法中非線性關(guān)系的深度不足并考慮了誤差，同時(shí)對局部最具特征的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，又在點(diǎn)的基礎(chǔ)上對整體的“面”進(jìn)行精準(zhǔn)預(yù)測，回歸擬合整體范圍內(nèi)各因素間的相互關(guān)系[14-15]，首先從單因素試驗(yàn)結(jié)果中篩選出培養(yǎng)基各營養(yǎng)鹽的適宜濃度，通過軟件找出優(yōu)化方向，最后求得優(yōu)化結(jié)果，有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高、性能優(yōu)[16]的優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)面反映的是NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7等4因素中任意2個(gè)因素取零水平時(shí)，剩余2個(gè)因素相互作用對小新月菱形藻藻細(xì)胞密度的影響。得出NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3和C6H8FeNO7的最佳質(zhì)量濃度分別為0.50、0.007 5、0.05、0.001 g/L，與原培養(yǎng)基比較，藻細(xì)胞密度提高28.15%。但響應(yīng)面法也存在一定不足，當(dāng)變量數(shù)較多時(shí)，不易準(zhǔn)確構(gòu)建一個(gè)近似多項(xiàng)式進(jìn)行確定性分析；另外，當(dāng)模型非線性強(qiáng)或誤差分布呈非正態(tài)分布時(shí)，尋找合適的優(yōu)化設(shè)計(jì)極為困難[17]。

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Optimization of Culture Medium ofby Response Surface Methodology

LI Qi, ZHANG Da-juan, ZHANG Shu-lin, WANG Ze-bin, JIA Ying-xuan,HUANG Lan-ying, LIANG Peng-fei, CHEN Xuan, LONG Cheng-feng

(,/,300392,)

【】 To optimize the culture medium of, and screen for optimal nutrient concentration suitable for the microalgae growth. 【】The concentration of NaNO3,NaH2PO4·H2O,Na2SiO3and C6H8FeNO7were screened among f/2medium by single factor test and the response surface methodology and verified test, and the medium formula ofwas optimized,. 【】In accordance with single factor, the nutrient concentrations suitable forare: NaNO3is 0.2,0.5 and 0.8 g/L, and NaH2PO4·H2O is 0.005, 0.007 5 and 0.01 g/L, and Na2SiO3is 0.02, 0.05and 0.08 g/L, and C6H8FeNO7is 0.001, 0.002 and 0.003 g/L. After being optimized by responding surface, the order of above 4 nutrients influencinggrowth is: NaNO3>NaH2PO4·H2O>C6H8FeNO7>Na2SiO3, and the optimal concentration of them are: NaNO30.5 g/L, NaH2PO4·H2O 0.007 5 g/L, Na2SiO30.05 g/L and C6H8FeNO70.002 g/L. Too high or too lownutrient concentration will inhibit the growth of. Cell density ofoptimizedculture medium group enhances 28.15%,significantly higher than that of f/2 medium group (< 0.05).

; nutrient; algal cell density; response surface methodology

李琦，張達(dá)娟，張樹林，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化小新月菱形藻培養(yǎng)基[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（3）：133-138

S917.1；Q949.27.8

A

1673-9159（2022）03-0133-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.03.018

2021-12-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32172978）；中央引導(dǎo)地方（天津）科技發(fā)展專項(xiàng)（21ZYCGSN00500；天津市淡水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)-養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控崗位（ITTFRS2021000-009）；天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2020ZD06，2021KJ110）；甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目民生科技專項(xiàng)（21CX6NP223）

李琦（1997―），男，碩士研究生，主要從事養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控研究。E-mail：lqdengdeng@163.com

張樹林（1963―），男，博士，教授，主要從事養(yǎng)殖水環(huán)境調(diào)控研究。E-mail：shulin63@sina.com

（責(zé)任編輯：劉慶穎）