王慧蓮，展俊平，苗喜云，孟慶良，馬俊福

河南省中醫(yī)院風濕病科，鄭州 450000

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以炎性細胞浸潤為特征的，滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和骨發(fā)生退變的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1]，其中滑膜炎癥是最主要的病理表現(xiàn)[2]?；こ衫w維細胞是滑膜的主要組成細胞，在RA發(fā)生發(fā)展過程中異常增生，并通過分泌炎性介質(zhì)進一步導致滑膜炎癥和軟骨損傷，是RA治療的重要靶細胞之一[3-4]。目前臨床上多采用非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、青霉胺等藥物治療RA，但易引發(fā)惡心、嘔吐、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等不良反應(yīng)，嚴重危害患者的健康[5]。近年來，中藥因來源廣、毒性小和藥效高等特點，成為RA治療的研究熱點[6-7]。中藥丹參常用于心血管疾病、糖尿病、皮膚病和關(guān)節(jié)炎等的治療中[8]，其主要活性成分丹酚酸B(salvianolic acid B)具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎等功效[9]。但目前丹酚酸B對RA的治療作用及其機制尚未明確。本研究探討了丹酚酸B對人RA滑膜成纖維細胞增殖和凋亡的影響及其機制，以期為丹酚酸B在RA中的應(yīng)用和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 丹酚酸B(純度98%)購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒購自美國Abcam公司；caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和β-actin蛋白一抗及二抗購自美國Santa Cruz公司；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自美國Sigma公司。流式細胞儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人R A 滑膜成纖維細胞M H 7 A(JNO171-925)購自廣州吉妮歐生物有限公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中。丹酚酸B用DMEM培養(yǎng)基配制為100 μmol/L的母液。取對數(shù)生長期MH7A細胞，接種于96孔板(2×103個/孔)進行藥物處理和分組培養(yǎng)。

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖情況 MH7A細胞分別加入含終濃度為0、1、10、20、30、40和50 μmol/L丹酚酸B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，隨后加入終濃度為5 mg/ml的MTT，37 ℃孵育4 h；棄上清，加入150 μl DMSO，采用酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度(OD)值，并計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(OD實驗組－OD空白組)/OD空白組×100%。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 MH7A細胞分別加入含終濃度為0、30、40和50 μmol/L丹酚酸B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，隨后加入0.5%胰蛋白酶進行消化；離心重懸后，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 細胞分組及處理 取對數(shù)生長期MH7A細胞，接種于96孔板(2×103個/孔)中，設(shè)置對照組、丹酚酸B組與丹酚酸B+3-MA組。對照組正常培養(yǎng)，丹酚酸B組加入終濃度為50 μmol/L的丹酚酸B培養(yǎng)，丹酚酸B+3-MA組加入50 μmol/L丹酚酸B和5 mmol/L自噬抑制劑3-MA共同培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，檢測各組細胞增殖和凋亡情況，caspase-3mRNA和蛋白的表達情況，以及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的表達情況。

1.3.1 各組細胞增殖和凋亡情況檢測 按照1.2.1和1.2.2方法檢測各組細胞增殖和凋亡情況。

1.3.2 qRT-PCR檢測capase-3mRNA相對表達水平

按Trizol試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA并測定其濃度。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，45個循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物由上海生工生物工程有限公司合成。Caspase-3：正義鏈5'-GAATCCACGAGCAGAGTCAA-3'，反義鏈5'-TAGCCTTCAACAAGCCAACC-3'；β-actin：正義鏈5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反義鏈5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'。以β-actin為內(nèi)參，采用2–ΔΔCt法計算caspase-3mRNA的相對表達水平。

1.3.3 Western blotting檢測caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62的相對表達水平

加入RIPA裂解液提取細胞總蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)模1 h，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和β-actin蛋白一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜；漂洗后加入二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。采用X線膠片曝光，用Image-Pro Plus 7.0軟件分析，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹酚酸B 對M H 7 A 細胞增殖和凋亡的影響 M T T 法 檢 測 結(jié) 果 顯 示，與0 μ m o l/L 組 比較，1、10和20 μmol/L丹酚酸B處理對MH7A細胞增殖沒有明顯影響(P>0.05)，而30、40、50 μmol/L丹酚酸B組MH7A細胞增殖率明顯降低(75.71%±5.36%、67.33%±6.32%、53.34%±2.73%vs.89.24%±3.10%)，且呈濃度依賴性(P<0.05，圖1A)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，30、40和50 μmol/L丹酚酸B組細胞凋亡率明顯升高(15.7%±0.5%、22.5%±1.7%、30.1%±1.5%vs.11.2%±1.3%，P<0.05，圖1B)。據(jù)此選擇50 μmol/L丹酚酸B進行后續(xù)實驗。

圖1 丹酚酸B對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.1 Effect of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis of MH7A cells

2.2 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細胞增殖和凋亡的影響 與對照組比較，丹酚酸B組細胞增殖率明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹酚酸B組比較，加入自噬抑制劑3-MA處理的MH7A細胞增殖率明顯升高(63.47%±1.94%vs. 51.33%±4.67%)，細胞凋亡率明顯降低(21.4%±1.8%vs. 30.4%±0.6%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of salvianolic acid B on the proliferation and apoptosis of MH7A cells by regulating autophagy

2.3 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細胞中caspase-3mR NA和蛋白以及自噬相關(guān)蛋白表達的影響Western blotting和qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，丹酚酸B組MH7A細胞中caspase-3mRNA(1.27±0.15vs. 0.61±0.03)和蛋白(1.10±0.09vs.0.42±0.07)相對表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹酚酸B組比較，丹酚酸B+3-MA組MH7A細胞中caspase-3mRNA(0.83±0.06)和蛋白(0.64±0.05)相對表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3A、B)。

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，丹酚酸B組MH7A細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(1.23±0.21vs. 0.23±0.03)、Beclin-1(1.05±0.08vs.0.22±0.04)蛋白相對表達水平升高，p62(0.20±0.02vs.1.38±0.08)蛋白相對表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與丹酚酸B組比較，丹酚酸B+3-MA組MH7A細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(0.29±0.07)、Beclin-1(0.36±0.05)蛋白相對表達水平降低，p62(0.97±0.06)蛋白相對表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3C)。

圖3 丹酚酸B調(diào)節(jié)自噬對MH7A細胞中caspase-3及自噬相關(guān)蛋白表達的影響Fig.3 Effect of salvianolic acid B on the expressions of caspase-3 and autophagy related protein in MH7A cells by regulating autophagy

3 討 論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，臨床上該病患者的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞和畸變，關(guān)節(jié)功能受到影響，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[10]。RA滑膜成纖維細胞的增殖與凋亡失衡是引起滑膜增生和關(guān)節(jié)炎癥的主要原因[11]。一方面，滑膜成纖維細胞增生對軟骨和骨關(guān)節(jié)等組織進行直接的浸潤和破壞；另一方面，滑膜成纖維細胞可通過募集免疫細胞并與其相互作用促進機體炎癥反應(yīng)，間接破壞骨關(guān)節(jié)[12]。因此，調(diào)控滑膜成纖維細胞是藥物治療RA的重要機制之一。

丹酚酸B是丹參的主要活性成分[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B具有抑制細胞異常增殖、誘導細胞凋亡的作用[14]。但目前關(guān)于丹酚酸B對RA滑膜成纖維細胞作用的研究較少。本研究采用不同濃度的丹酚酸B作用于MH7A細胞，結(jié)果顯示，低濃度(1、10、20 μmol/L)的丹酚酸B對MH7A細胞增殖沒有明顯影響，而30～50 μmol/L的丹酚酸B可呈濃度依賴性的抑制MH7A細胞的增殖。進一步檢測有效濃度的丹酚酸B對MH7A細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，丹酚酸B可明顯促進MH7A細胞凋亡。由此可見，丹酚酸B能夠有效抑制RA滑膜成纖維細胞的增殖并促進其凋亡，提示丹酚酸B可能對RA有治療作用。

目前RA的病因和發(fā)病機制尚未完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞自噬是RA進展的重要調(diào)節(jié)機制之一[15]。自噬又稱為Ⅱ型程序性死亡，是可溶性大分子或細胞器等被運送到溶酶體進行降解的過程，在維持細胞穩(wěn)態(tài)和生存方面發(fā)揮著重要作用[16]。Beclin-1(又稱Atg6)是自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子之一，可與其他Atg蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)自噬體的形成，進而調(diào)控細胞自噬過程[17]。LC3是檢測自噬活性的標志蛋白[18]。在自噬過程中，胞質(zhì)內(nèi)的Ⅰ型LC3蛋白經(jīng)過泛素樣加工修飾后，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成Ⅱ型LC3蛋白。LC3-Ⅱ蛋白特異性地結(jié)合至自噬泡膜表面，并在自噬體形成過程中發(fā)揮重要作用，因此常用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值評估自噬水平[19]。銜接蛋白p62可與LC3相互結(jié)合，是自噬受體和自噬的選擇性底物[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可通過促進細胞自噬減緩腎炎、腎纖維化、帕金森病、結(jié)直腸癌等疾病的發(fā)展[21-24]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，丹酚酸B組MH7A細胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表達上調(diào)，p62表達下調(diào)，表明丹酚酸B可促進RA滑膜成纖維細胞的自噬過程。

自噬廣泛參與心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展[25]。許珂等[26]發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤可通過誘導細胞自噬而促進RA滑膜成纖維細胞的凋亡，提高RA的治療效果。范紫微等[27]研究發(fā)現(xiàn)，五味子木脂素可通過促進自噬而抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)。本研究采用自噬抑制劑3-MA和丹酚酸B共處理MH7A細胞，結(jié)果顯示，MH7A細胞增殖率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，表明丹酚酸B對RA滑膜成纖維細胞增殖和凋亡的調(diào)控作用可能是通過促進自噬產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，丹酚酸B可通過促進細胞自噬抑制RA滑膜成纖維細胞的增殖并促進其凋亡。但本研究未在RA動物模型中探索丹酚酸B的藥物毒性和適用濃度，后續(xù)研究可在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中驗證丹酚酸B的作用，并探索其衍生物和適用劑型，為丹酚酸B在臨床RA治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。