張楚悅，危群，楊裔堅，錢程，付必莽，謝楠，魏雷，李春滿，蘇瑩珍

1昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科，昆明 650032；2昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科，昆明 650032；3昆明學院醫(yī)學院公共衛(wèi)生教研室，昆明 650214

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是發(fā)生于大腸黏膜上皮和腺體的惡性腫瘤，大多數(shù)呈散發(fā)性[1-2]，僅少數(shù)有遺傳背景，其中遺傳性非息肉病性大腸癌[又稱林奇綜合征(Lynch syndrome，LS)]占CRC的3%～5%，90%以上的LS和10%～15%的散發(fā)性CRC與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)有關[3]。轉化生長因子β Ⅱ型受體(transforming growth factor β receptor Ⅱ，TGFβR2)基因位于人染色體3p22，含有6個內(nèi)含子和7個外顯子，編碼蛋白分子量為70～80 kD，由567個氨基酸組成屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體家族[4]。TGFβR2在CRC中表達缺失或下降可促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，且90%以上的TGFβR2突變發(fā)生在MSI CRC中[4]。本研究探討CRC中TGFβR2表達與MSI的關系，分析兩者與CRC臨床病理參數(shù)的相關性，以期為獲得可用于CRC早期診斷、治療及病情評價的生物標志物奠定基礎，為探尋CRC靶向治療及免疫檢查點治療的新靶點提供思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2019年1月1日－9月30日于昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院接受結直腸癌根治性手術的184例CRC患者的CRC組織(原發(fā)病灶組織)及癌旁組織(結腸癌切緣距離腫瘤≥10 cm、中高位直腸癌遠端切緣距離腫瘤≥5 cm、低位直腸癌遠端切緣距離腫瘤≥2 cm)，其中，結腸包括升結腸、橫結腸、降結腸和乙狀結腸。納入標準：術前未接受放療、化療等任何治療；臨床資料和組織病理學資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；復發(fā)性結直腸癌；手術未達到R0切除；術中淋巴結清掃不足12個。CRC患者各項病理資料(包括性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤最大直徑、分化程度、淋巴結轉移個數(shù)、TNM分期、組織病理類型、腫瘤浸潤深度、是否有脈管內(nèi)癌栓、腫瘤有無遠處轉移)由昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科提供。病理分期標準按照美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)結直腸癌TNM分期系統(tǒng)(2017年第八版)確定。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學醫(yī)學倫理委員會審核。

1.2 主要試劑及儀器 MLH1(M AB-0838)、M S H 2(M A B-0 8 3 6)、M S H 6(M A B-0 8 3 1)、PMS2(MAB-0656)抗體及羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；兔抗TGFβR2抗體(ab270440)購自英國Abcam公司；DNA提取試劑盒(TSP201-200)購自北京擎科生物科技有限公司；反轉錄試劑盒EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit購自上海翊圣生物科技有限公司；EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒購自武漢ELK Biotechnology公司。組織切片處理機購自德國Leica公司；倒置顯微鏡IX53購自日本Olympus公司；PCR儀購自杭州朗基科學儀器有限公司；StepOneTMqRT-PCR儀購自美國Life Technologies公司。

1.3 免疫組化染色(IHC)檢測錯配修復(mismatch repair，MMR)蛋白和TGFβR2蛋白的表達情況 取CRC組織和癌旁組織，加入10%多聚甲醛溶液固定12～24 h，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋制成石蠟塊，切片后脫蠟和復水，EDTA法進行抗原修復，30%過氧化氫室溫孵育15 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；滴加MLH1(1:250)、MSH2(1:250)、MSH6(1:250)、PMS2(1:250)一抗，于37 ℃恒溫箱中孵育1h；滴加即用型羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，于37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h，DAB顯色0.5～1 min后復染，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察MMR蛋白和TGFβR2蛋白的表達情況。MMR蛋白包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，其中4種MMR蛋白均表達提示為微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定(microsatellite instability low-frequency，MSI-L)/微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability，MSS)，1種或多種MMR蛋白表達缺失提示為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(microsatellite instability high-frequency，MSI-H)，陽性判定標準參照文獻[5]。依據(jù)IHC檢測結果，將184例CRC患者分為MSI-H組與MSI-L/MSS組，比較兩組的臨床病理參數(shù)。

1.4 多重熒光PCR毛細管電泳法(CE)檢測MSI 采用動物DNA提取試劑盒(TSP201-200)提取CRC組織和癌旁組織DNA，5'端合成5/6-羥基熒光素(FAM)引物，R引物合成PAGE引物，DNA樣品稀釋后作為PCR模板，以2×TSINGKE Master Mix (blue)進行擴增，將擴增后的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳(電壓300 V，時間12 min)，獲取鑒定膠圖，加水稀釋至毛細管電泳所需濃度后行毛細管檢測，收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.5 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測TGFβR2mRNA相對表達量 提取CRC組織和癌旁組織總RNA，按照反轉錄試劑盒EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書步驟合成cDNA，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix試劑盒進行擴增，每個樣品設置3個復孔。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2–ΔΔCt法計算TGFβR2mRNA相對表達量。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.6 IHC與CE檢測MSI結果的一致性分析 采用Kappa一致性檢驗分析IHC與CE檢測MSI結果的一致性。

1.7 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，經(jīng)大樣本正態(tài)性檢驗，TGFβR2mRNA相對表達量不服從正態(tài)分布，其與臨床病理參數(shù)的關系分析采用配對樣本非參數(shù)秩和檢驗；TGFβR2mRNA在MSI-H組和MSI-L/MSS組中的表達分析采用Wilcoxon符號兩獨立樣本秩和檢驗；TGFβR2mRNA在CRC組織和癌旁組織中的表達分析采用配對樣本非參數(shù)秩和檢驗；計數(shù)資料以例(%)表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 CRC組織及癌旁組織樣本的MSI狀態(tài) CE檢測結果顯示，184例CRC組織樣本中，152例(82.6%，152/184)為MSI-L/MSS，表現(xiàn)為只有一個位點不穩(wěn)定(MSI-L)，或無不穩(wěn)定位點(MSS)；32例(17.4%，32/184)為MSI-H，表現(xiàn)為兩個或多個位點不穩(wěn)定(圖1、表2)。

IHC檢測結果顯示，4種MMR蛋白陽性反應產(chǎn)物定位于細胞核，為棕黃色或棕褐色顆粒。184例CRC組織樣本中，154例(83.7%，154/184)為MSI-L/MSS，表現(xiàn)為4種MMR蛋白均表達；30例(16.3%，30/184)為MSI-H，表現(xiàn)為1種或多種MMR蛋白表達缺失(圖1、表2)。

圖1 CE與IHC檢測CRC組織中MSI的狀態(tài)Fig.1 CE and IHC detect MSI status in CRC organization

2.2 CE與IHC檢測MSI結果的一致性 Kappa檢驗結果顯示，Kappa一致性系數(shù)為0.922(P<0.001)，拒絕接受零假設，CE與IHC檢測MSI的主體結果存在高度一致性(表2)。

表2 CE和IHC檢測MSI結果的一致性分析Tab.2 Consistency analysis of MSI results detected by CE and IHC

2.3 MSI-H組與MSI-L/MSS組CRC患者臨床病理參數(shù)比較 依據(jù)IHC檢測結果，將184例CRC患者分為MSI-H組(n=30)與MSI-L/MSS組(n=154)，MSI-H多發(fā)生于結腸、無淋巴結轉移及TNM分期Ⅰ－Ⅱ期的CRC，MSI-L/MSS多發(fā)生于高、中分化的CRC(P<0.05，表3)。

表3 MSI-H組與MSI-L/MSS組CRC患者臨床病理參數(shù)比較[例(%)]Tab.3 Comparison of clinicopathological parameters of CRC patients between MSI-H group and MSI-L/MSS group [n(%)]

2.4 TGFβR2蛋白在CRC組織中的表達情況 IHC檢測結果顯示，TGFβR2蛋白陽性反應產(chǎn)物定位于細胞膜和細胞質(zhì)，顏色為棕褐或棕黃色，在細胞膜上呈線狀，在細胞質(zhì)內(nèi)呈彌漫狀。TGFβR2蛋白在CRC組織中低表達或不表達，陽性表達率為27.7%(51/184)；在癌旁組織中高表達，陽性表達率為85.9%(158/184)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2)。

圖2 TGFβR2蛋白在CRC組織中的表達情況(IHC ×200)Fig.2 Expression of TGFβR2 protein in CRC tissues (IHC ×200)

2.5TGFβR2基因突變與MSI的關系 30例MSI-H CRC組織中，28例(93.3%，28/30)TGFβR2蛋白表達缺失；154例MSI-L/MSS CRC組織中，23例(14.9%，23/154)TGFβR2蛋白表達缺失。TGFβR2基因在MSI-H CRC組織中的突變率高于MSI-L/MSS CRC組織(χ2=77.028，P<0.01)。

2.6TGFβR2mRNA在CRC組織中的表達情況qRT-PCR檢測結果顯示，MSI-H組TGFβR2mRNA相對表達量高于MSI-L/MSS組，差異有統(tǒng)計學意義(7.93±0.36vs. 4.47±1.31，Z=–4.782，P<0.01，圖3A)；癌旁組織中TGFβR2mRNA相對表達量高于CRC組織，差異有統(tǒng)計學意義(9.38±0.82vs.4.76±1.63，Z=–11.763，P<0.01，圖3B)。

圖3 TGFβR2 mRNA在CRC組織中的表達情況Fig.3 Expression of TGFβR2 mRNA in CRC tissues

2.7TGFβR2mRNA相對表達量與臨床病理參數(shù)的關系TGFβR2mRNA相對表達量在無遠處轉移、無淋巴結轉移、TNM分期Ⅰ－Ⅱ期的CRC組織中較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表4)。

表4 TGFβR2 mRNA相對表達量與CRC患者臨床病理參數(shù)的關系(±s)Tab.4 Relationship bet ween TGFβR2 mRNA and clinicopathological parameters of CRC patients (±s)

表4 TGFβR2 mRNA相對表達量與CRC患者臨床病理參數(shù)的關系(±s)Tab.4 Relationship bet ween TGFβR2 mRNA and clinicopathological parameters of CRC patients (±s)

臨床病理參數(shù) 構成[例(%)] TGFβR2 mRNA Z P性別 –0.196 0.845男101(54.9) 5.10±1.63女83(45.1) 4.96±1.91年齡(歲) –0.607 0.544<60 64(34.8) 4.96±1.91≥60 120(65.2) 5.08±1.68腫瘤部位 –6.472 0.000結腸 101(54.9) 5.76±1.53直腸 83(45.1) 4.15±1.62腫瘤最大直徑(cm) –0.849 0.396<5 115(62.5) 4.94±1.68≥5 69(37.5) 5.20±1.89分化程度 –1.653 0.098高、中分化 138(75.0) 5.11±1.47低分化 46(25.0) 4.81±2.45淋巴結轉移 –9.415 0.000陽性 77(41.8) 3.67±1.53陰性 107(58.2) 6.02±1.16 TNM分期 –9.290 0.000Ⅰ－Ⅱ 108(58.7) 5.99±1.19Ⅲ－Ⅳ 76(41.3) 3.68±1.54

3 討 論

微衛(wèi)星DNA廣泛分布于原核及真核生物基因組中，最主要的特征是突變率非常低，可作為衡量基因組穩(wěn)定性的良好標志物。MMR系統(tǒng)出現(xiàn)異常會引起錯配修復功能缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)，使微衛(wèi)星的復制錯誤無法及時糾正并不斷積累造成MSI[6-8]。由于MSI腫瘤中大量基因突變，產(chǎn)生了多種新的特異性抗原，這些新抗原在體內(nèi)經(jīng)過加工、提呈和識別激活了免疫系統(tǒng)，因此MSI腫瘤預后較好[9]。研究發(fā)現(xiàn)，MSI CRC患者大多表現(xiàn)為TNM分期較早、較少發(fā)生淋巴結轉移和遠處轉移，對化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)耐受[10]，而對細胞程序性死亡受體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)抑制劑(如帕博利珠單抗和納武利尤單抗)敏感，是CRC預后評估和療效評價的有效指標[10-11]。

(續(xù) 表)

TGFβ信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，TGFβ結合TGFβR2是該信號通路的起點[12]。TGFβR2廣泛分布于正常細胞和腫瘤細胞表面。有研究發(fā)現(xiàn)，TGFβR2在腫瘤中表達缺失或下降能促進腫瘤的發(fā)生和進展，提示TGFβR2是一種抑癌基因，TGFβR2在CRC組織中較正常組織表達下調(diào)，且TGFβR2低表達的CRC患者整體生存率低于TGFβR2高表達的患者[4]，因此，TGFβR2可作為獨立的預后因子。Grady等[13]對38種CRC細胞株進行研究發(fā)現(xiàn)，其中11種表現(xiàn)為MSI(其中9種CRC細胞株中TGFβR2表達缺失)，27種表現(xiàn)為MSS(其中3種CRC細胞株中TGFβR2表達缺失)，因此TGFβR2突變與伴有MSI的CRC密切相關。

本研究采用IHC檢測184例CRC組織樣本發(fā)現(xiàn)，dMMR表型有30例，pMMR表型有154例；采用CE檢測CRC組織樣本發(fā)現(xiàn)，30例dMMR表型CRC組織中有29例為MSI-H，1例為MSI-L/MSS；154例pMMR表型CRC組織中有3例為MSI-H，151例為MSI-L/MSS。假設CE檢測結果為真，則IHC檢測的敏感度和特異度分別為90.6%和99.3%，兩者準確度的一致性為97.8%；假設IHC檢測結果為真，則CE檢測的敏感度和特異度分別為96.7%和98.1%，兩者準確度的一致性為97.8%。由于IHC的敏感度高于CE，因此本研究數(shù)據(jù)以IHC檢測結果為準，即184例CRC樣本中，dMMR表型有30例，pMMR表型有154例。通過Kappa檢驗得出，Kappa一致性系數(shù)為0.922(P<0.05)，拒絕接受零假設，CE與IHC檢測的主體結果存在高度一致性(表2)。兩種方法檢測的結果差異有統(tǒng)計學意義且一致性為97.8%，與Shia等[14]的研究結果相近。對比分析兩種方法檢測MSI的結果，發(fā)現(xiàn)IHC的敏感度高于CE，而特異度相反，與Karahan等[15]的研究結果一致。因此，使用簡便、快捷且經(jīng)濟的IHC檢測CRC組織MMR蛋白可作為一種初篩手段，易于在臨床工作中開展。Ashktorab等[16]收集1997－2015年15 105例CRC患者進行Meta分析，結果顯示，Ⅲ期和Ⅳ期CRC患者多表現(xiàn)為MSI-H，本研究結果與之不一致。分析其原因為，本研究對象為術后CRC患者且大多數(shù)TNM分期較早，而大部分Ⅳ期患者接受了放化療及靶向藥物治療，接受手術患者較少，并且Ashktorab等[16]的研究起始時間為1997年，時間偏早且篩查手段和診斷技術受到限制，大多數(shù)患者在治療時處于晚期。本研究中MSI-H CRC患者多為Ⅰ－Ⅱ期，與MSI-L/MSS組相比，MSI-H組患者較少出現(xiàn)淋巴結轉移，可能與MSI-H引起較強的免疫反應有關，后者可以協(xié)助機體抵抗腫瘤細胞對機體的攻擊，從而抑制腫瘤向淋巴結轉移，最終導致MSI-H腫瘤較MSI-L/MSS腫瘤預后好。本研究中MSI-H CRC多無腫瘤遠處轉移，與Ward等[17]的研究結果一致，但由于本研究納入樣本量有限，所以無明顯統(tǒng)計學差異。

TGFβ信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，TGFβ結合TGFβR2是該信號通路的起點[18]。研究發(fā)現(xiàn)，TGFβR2為抑癌基因[4]。王朝暉等[19]發(fā)現(xiàn)，伴有MSI的18例CRC中，16例發(fā)生TGFβR2突變，突變率為88.9%，與本研究結果一致。本研究運用qRT-PCR分別對MSI-H組和MSI-L/MSS組CRC患者TGFβR2mRNA的表達情況進行檢測，結果顯示，與癌旁組織相比，CRC組織中TGFβR2mRNA相對表達量降低，分析原因可能與TGFβR2阻礙腫瘤細胞的生長、擴散有關，但其具體作用機制尚未明確。與MSI-H組相比，MSI-L/MSS組中TGFβR2mRNA相對表達量偏低，這可能與研究樣本的差異以及CRC的復雜性有關。MSI和TGFβR2的表達與臨床病理特征中腫瘤發(fā)生部位、淋巴結是否轉移、TNM分期和腫瘤有無遠處轉移有關。MSI-H多發(fā)生于結腸，TGFβR2在結腸部位的表達量偏高；MSI-H CRC傾向于淋巴結轉移陰性，TGFβR2在淋巴結無轉移的CRC組織中表達量偏高；MSI-H CRC的TNM分期大多為Ⅰ－Ⅱ期，TGFβR2在Ⅰ－Ⅱ期CRC組織中表達偏高，且兩者均與性別、年齡、病理類型及腫瘤浸潤深度無關。

本研究存在以下局限性：(1)由于入組患者有限，研究結果可能存在偏倚；(2)采用CE和IHC檢測CRC的MSI狀態(tài)時未進行相關基因測序分析，且兩種檢測結果的對比分析缺乏金標準，因此得到的數(shù)據(jù)可能存在偏差；(3)對可疑的LS患者，未收集其家族史信息，缺乏完整的家系資料，影響了本研究分析的深度和廣度。

綜上所述，M S I-H C R C 預后較好可能與TGFβR2低表達或缺失有關，TGFβR2低表達或缺失與MSI關系密切。基于MSI和TGFβR2的分子機制并結合其特點，對個體化治療具有指導意義，或可成為評估CRC生存預后的驅(qū)動基因；通過評價CRC中TGFβR2的表達與臨床病理特征的關系，或可尋找到預測CRC患者生存預后的新的生物標志物。