陳林濤 姚毅明 周學(xué)偉 王紅雷

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是一種消化道系統(tǒng)的惡性腫瘤，近年來(lái)，結(jié)直腸癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，且生存率偏低，5年生存率仍低于40%[1-2]，這主要是飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、癌癥的早期篩查不足所導(dǎo)致的[3]。因此，篩選有效且靈敏的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物對(duì)其預(yù)防、早期診斷和預(yù)后改善具有重要意義。LRFN4屬于LRFN家族蛋白，是一種神經(jīng)元特異性蛋白，研究報(bào)道，LRFN4可在多種腫瘤中表達(dá)[4]。乙醛脫氫酶1A1(ALDH1A1)在胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中異常表達(dá)，且與預(yù)后有關(guān)。ALDH1B1與ALDH1A1具有同源性，且ALDH1B1在正常小腸、肝臟和胰腺組織中呈高水平表達(dá)[5-6]。但LRFN4、ALDH1B1表達(dá)在結(jié)直腸癌中的研究較少，因此本研究分析LRFN4、ALDH1B1與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討LRFN4、ALDH1B1與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年1月本院收治的結(jié)直腸癌患者90例，年齡18～69歲，平均(57.32 ±7.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2020年版)》[7]中關(guān)于結(jié)直腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者經(jīng)病理檢查確診為結(jié)直腸癌； ② 接受規(guī)范性的結(jié)直腸癌根治手術(shù)，且術(shù)前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療；③患者簽署自愿受試同意書(shū)及知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷信息和隨訪資料不完整；②合并其他惡性腫瘤患者；③術(shù)前已轉(zhuǎn)移、接受姑息性切除的患者。

1.2 ALDH1B1、LRFN4檢測(cè)

收集結(jié)直腸癌組織，采用Quick-Ray手動(dòng)組織芯片儀(美國(guó)UNITMA公司)取直徑2.0 mm的組織制成組織微陣列(TMA)芯片蠟塊，經(jīng)脫蠟水化與抗原修復(fù)后，分別滴加兔抗人LRFN4抗體以及ALDH1B1抗體(賽默飛世爾科技有限公司)，PBS沖洗后滴加二抗(賽默飛世爾科技有限公司)。免疫組化結(jié)果：在高倍鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度分值：0分(陰性)、1分(弱陽(yáng)性)、2分(中等陽(yáng)性)、3分(強(qiáng)陽(yáng)性)。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比0～1%為0分，>1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞的百分比兩者相乘獲得0～12分的總?cè)旧梅?，其?～4分定義為低表達(dá)或無(wú)表達(dá)，5～12分定義為高表達(dá)。

1.3 臨床資料收集及隨訪

通過(guò)查閱患者病歷檔案，收集患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、TNM分期等。采用電話或門(mén)診復(fù)診等隨訪方式，截止時(shí)間為2021年2月。記錄患者的總生存期(overall survival，OS)：確診之日至患者死亡或最后1次隨訪日期。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者組織ALDH1B1、LRFN4的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

在結(jié)直腸癌組織中LRFN4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、組織學(xué)分級(jí)等病理特征無(wú)關(guān)(P>0.05)；在結(jié)直腸癌組織中ALDH1B1表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與其他病理特征無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌患者組織ALDH1B1、LRFN4的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系/例

2.2 ALDH1B1、LRFN4表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示：LRFN4高表達(dá)患者的總生存率顯著高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)；ALDH1B1高表達(dá)患者的總生存率顯著低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)。見(jiàn)圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者 Kaplan-Meier生存曲線

2.3 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的單因素和多因素分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)ALDH1B1表達(dá)、LRFN4表達(dá)和TNM分期與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)，將上述單因素引入多因素Cox回歸模型分析發(fā)現(xiàn)ALDH1B1表達(dá)、LRFN4表達(dá)和TNM分期是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響指標(biāo)，見(jiàn)表2。

表2 ALDH1B1、LRFN4與預(yù)后的單因素和多因素分析

3 討論

結(jié)直腸癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，是全球第三大常見(jiàn)惡性腫瘤，雖然目前在對(duì)其的治療取得了很大的進(jìn)步，但是治療后的結(jié)直腸癌患者依然存在轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。因此結(jié)直腸癌在治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)上面臨巨大挑戰(zhàn)，尋找能預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物是目前臨床上關(guān)注的重點(diǎn)。 ALDHs是一組催化醛類(lèi)氧化為羧酸的依賴性酶，已被研究證實(shí)可作為多種癌癥的生物標(biāo)志物[10]，其中ALDH1是ALDHs超家族成員之一，ALDH1的亞型包括ALDH1B1和ALDH1A1[11]。研究報(bào)道ALDH1B1在肺、乳腺、卵巢的腺癌組織中均有表達(dá)，另外有研究顯示ALDH1B1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且高于ALDH1A1陽(yáng)性表達(dá)率[12-13]。本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中ALDH1B1表達(dá)與TNM分期顯著相關(guān)，ALDH1B1高表達(dá)患者的總生存率顯著低于低表達(dá)組，且ALDH1B1表達(dá)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。這提示ALDH1B1表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后有關(guān)，ALDH1B1表達(dá)與患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明ALDH1B1在結(jié)直腸癌的表達(dá)越高，其患者預(yù)后越差。 LRFN又稱突觸黏附樣分子，共有5名家族成員，其結(jié)構(gòu)域相似，但是各自的功能不同，以前的研究?jī)H限于LRFN家族成員在神經(jīng)組織的表達(dá)和功能上的探討，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LRFN1的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞的存活率發(fā)生下降，在某些包括Panc-1、MKN7等癌細(xì)胞系中也會(huì)發(fā)現(xiàn)LRFN4的表達(dá)[14-15]。腫瘤細(xì)胞可以募集包括間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[16-17]。其中免疫細(xì)胞可通過(guò)誘導(dǎo)和維持腫瘤血管生成，刺激腫瘤細(xì)胞增殖、組織浸潤(rùn)，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[18-19]。根據(jù)研究報(bào)道在具有巨噬細(xì)胞分化的單核細(xì)胞中LRFN4的表達(dá)被上調(diào)，在誘導(dǎo)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向炎癥區(qū)域的遷移中起到了關(guān)鍵性作用，因此可以推測(cè)LRFN4有參與結(jié)直腸癌的傳播、復(fù)發(fā)等過(guò)程，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞免疫、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受限制[20-21]。本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中LRFN4表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)，LRFN4高表達(dá)患者的總生存率顯著高于低表達(dá)組，顯著降低了結(jié)直腸癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，是結(jié)直腸癌患者獨(dú)立預(yù)后的指標(biāo)。這提示結(jié)直腸癌組織中LRFN4高表達(dá)可能起著抑制腫瘤進(jìn)展的作用，可能成為評(píng)估患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中ALDH1B1、LRFN4的表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，有成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，亦有望成為腫瘤生物治療的新靶點(diǎn)。然而，本研究存在一定的不足，首先本研究?jī)H限于臨床樣本分析，未在細(xì)胞及動(dòng)物層次上進(jìn)一步分析ALDH1B1和LRFN4表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的作用機(jī)制；其次本研究為單一中心，收集樣本為90例，存在樣本量不足的問(wèn)題，結(jié)果可能產(chǎn)生偏移，需要未來(lái)制定更具前瞻性的試驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證。