王 慧 鄭亞云 張隆陶 岳 鑫

肝癌為常見惡性腫瘤，惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。肝癌病變過程中組織內(nèi)新生血管形成、間質(zhì)成分變化等易增加組織硬度、降低其彈性[1-2]。實時剪切波彈性成像為測量肝臟組織彈性與硬度的檢查方式，通過測量超聲剪切波速度以定量評估組織彈性與硬度。近年來臨床逐漸開始使用超聲剪切波速度進行肝癌診斷、病情評估，但對于其與病灶內(nèi)血管新生、癌細胞生長關(guān)系尚不明確[3-5]。血管新生為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的重要病理基礎(chǔ)，主要發(fā)病機制為"開關(guān)平衡學(xué)說"，即促進與抑制因子間動態(tài)平衡以調(diào)節(jié)血管新生[6-7]。Survivin為新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡抑制蛋白家族成員，能抑制細胞凋亡，還可調(diào)節(jié)細胞周期并保護腫瘤血管等；Survivin在組織中分布具有細胞選擇性，生理下可表達于胚胎、發(fā)育的胎兒組織、多數(shù)腫瘤組織中，但未在分化成熟的正常組織中表達[8]。PTEN為第一個具有酪氨酸磷酸酶的抑癌基因，該基因定位于染色體10q23.3，由8個內(nèi)含子和9個外顯子組成，編碼的PTEN廣泛存在于人體肝臟、胃腸道等多個組織中[9-10]。為此，本研究通過比較肝癌病灶及癌旁組織的超聲剪切波速度，并分析該水平與血管新生因子及Survivin、PTEN表達關(guān)系，旨在為臨床對肝癌診療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月～2020年2月于我院行手術(shù)治療的78例肝癌患者，其中男性49例，女性29例；年齡47～70歲，平均(59.63±7.85)歲。納入標準：符合《原發(fā)性肝癌的分層篩查與監(jiān)測指南(2020版)》標準[11]，且經(jīng)病理活檢穿刺確診為肝癌；具有手術(shù)切除指征；簽署知情同意書。排除標準：術(shù)前接受放化療治療患者；精神疾病或意識障礙患者；預(yù)生存期<3個月患者；合并其他惡性腫瘤患者。

1.2 方法

肝臟超聲剪切波速度評估方法[12]：患者取左側(cè)臥位或仰臥位，右臂上抬，使用彩色多普勒超聲診斷儀(西門子，型號Acuson S2000)具有聲觸診組織量化技術(shù)軟件，將探頭放于患者肋間隙，取樣框盡可能避開肝內(nèi)膽管與大血管；感興趣區(qū)域距探頭4～5 cm部位，使感興趣區(qū)上方距肝包膜超過1 cm，囑咐患者屏住呼吸以獲得肝臟超聲剪切波速度，存圖記錄。于一次屏氣的同一部位進行4～6次連續(xù)測定，重復(fù)操作獲得25～30個肝臟超聲剪切波速度，取其平均值作為肝臟超聲剪切波速度；檢查均由同一名具體經(jīng)驗的影像學(xué)醫(yī)師操作完成。

血管新生因子水平檢測方法：抽取患者空腹肘靜脈血，使用肝素鈉進行抗凝處理，于室溫下靜置分層，離心取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等血管新生因子含量。

Survivin、PTEN基因檢測方法[13]：取肝癌患者術(shù)中留取的癌組織標本，使用Trizol試劑(來源于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)將細胞進行裂解，加入氯仿后離心取其上層無色水相；向其加入等體積異丙醇混勻、將液體中總RNA進行沉淀，用75%乙醇清洗并于室溫下干燥。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(來源于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)操作說明要求合成樣品cDNA，再按熒光定量PCR試劑盒(來源于賽默飛世爾公司)操作說明要求，行Survivin、PTEN基因，獲得相對應(yīng)的PCR擴增曲線，計算目前基因mRNA相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肝臟超聲剪切波速度結(jié)果比較

癌旁病灶剪切波速度為(1.38±0.21)m/s，肝癌病灶為(2.85±0.36)m/s，肝癌病灶的剪切波速度高于癌旁病灶(P<0.05)。肝癌病灶超聲剪切波速度中位數(shù)為2.78 m/s，以此界限將患者分為低剪切波速度35例、高剪切波速度43例。見表1。

表1 肝臟超聲剪切波速度結(jié)果

2.2 不同剪切波速度病灶中血管新生因子水平比較

高剪切波速度病灶中VEGF、MMP-9水平高于低剪切波速度病灶(P<0.05)。見表2。

表2 不同剪切波速度病灶中血管新生因子水平比較

2.3 不同剪切波速度病灶中Survivin、PTEN表達量比較

高剪切波速度病灶中Survivin表達量高于低剪切波速度病灶，PTEN表達量低于低剪切波速度病灶(P<0.05)。見表3。

表3 不同剪切波速度病灶中Survivin、PTEN表達量比較

2.4 剪切波速度與病灶內(nèi)血管新生因子、Survivin、PTEN相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，肝臟超聲剪切波速度與病灶內(nèi)血管新生因子VEGF、MMP-9水平及Survivin表達量呈正相關(guān)(P<0.05)，與PTEN表達量呈負相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 剪切波速度與病灶內(nèi)血管新生因子、Survivin、PTEN相關(guān)性分析

3 討論

肝癌是源于肝內(nèi)干細胞惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為肝區(qū)疼痛、脾大、腹水等癥狀，是臨床常見且惡性程度較高的腫瘤。肝癌發(fā)病機制尚不明確，可能與食用含有黃曲霉素食物、慢性病毒肝炎及飲用污染水等因素有關(guān)[14-15]。隨著醫(yī)療技術(shù)不斷成熟與進步，肝癌早期診斷及生存率得到較大提升，但5年生存率尚無改善，加上大多數(shù)患者就診時已處于晚期，錯失最佳治療時期。故尋找肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制，基于此探索肝癌治療新途徑并尋找對肝癌有早期診斷價值的腫瘤標志物具有重要意義。

肝癌惡性程度高，主要生物學(xué)特征為細胞增殖活躍、新生血管旺盛，治療中病灶易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差且生存率低。臨床實踐經(jīng)驗顯示，早期診斷發(fā)現(xiàn)肝癌并評估其生物學(xué)特征對提高患者生存率具有重要意義[16-17]。肝癌病程進展中細胞外基質(zhì)降解與合成異常、微血管大量形成、結(jié)締組織異常沉積等情況易增加病灶組織硬度并降低其彈性。腹部超聲為肝臟病變評估常用方式，常規(guī)二維超聲、彩色超聲能及時發(fā)現(xiàn)病灶，但無法評估癌組織硬度與彈性。實時剪切波彈性成像是近年來臨床中新發(fā)展的超聲檢查技術(shù)，可通過測定剪切波速度定量評估組織彈性與硬度[18-20]。本研究檢查結(jié)果顯示，肝癌病灶的剪切波速度高于癌旁病灶，說明肝癌病灶硬度較高，其彈性低，病灶組織剪切波速度顯著上升[21]。正常或病理狀態(tài)下，血管新生伴有不同程度炎性細胞發(fā)生浸潤，血管新生和炎癥趨化因子關(guān)系逐漸受到重視。肝癌復(fù)發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高，病灶內(nèi)血管新生增多與其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)[22-25]。腫瘤內(nèi)血管新生為癌細胞吸取氧氣與養(yǎng)分基礎(chǔ)，患者體內(nèi)促血管新生因子呈高表達，則間接反映腫瘤惡性程度。VEGF為促血管新生能力最強因子，在多種癌組織中均呈高表達；MMP-9為兼具細胞外基質(zhì)分解、促血管新生的基質(zhì)金屬蛋白酶，可在VEGF誘導(dǎo)下促進表達[26-27]。本研究中高剪切波速度病灶中VEGF、MMP-9水平高于低剪切波速度病灶，說明肝癌患者剪切波速度與血管新生因子成正相關(guān)[28-29]。

癌基因是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生的主要因素，生理狀態(tài)下在機體中處于相對抑制表達狀態(tài)，當(dāng)表達異常上升易誘發(fā)細胞惡變。Survivin蛋白又稱存活素，為凋亡抑制蛋白家族新成員，是目前發(fā)現(xiàn)抗凋亡效果最強的蛋白，廣泛表達于腫瘤組織中[30]。Survivin在組織細胞中可存在于細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)，部分學(xué)者認為該蛋白的分布位置不同是因為轉(zhuǎn)錄后修飾不同導(dǎo)致。Survivin生物學(xué)功能較多，能抑制細胞凋亡，可促進血管生成，也能參與細胞有絲分裂。抑制細胞凋亡是Survivin最核心的生物學(xué)功能，細胞凋亡是受到機體中凋亡信號誘導(dǎo)而出現(xiàn)的細胞程序性死亡，Caspase蛋白活化是參與細胞凋亡的核心機制，Survivin是通過滅活Caspse蛋白而抑制細胞凋亡。血管內(nèi)皮生長因子能誘導(dǎo)三維毛細血管網(wǎng)生成并維持血管功能，Survivin表達能上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達，該過程為Survivin促進血管生成機制[31]。Survivin由于不表達于正常組織中，但在大多惡性腫瘤組織中表達成為目前研究最熱門的凋亡蛋白抑制因子，對多種腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響。目前對Survivin在肝癌組織中表達研究有限，故使用組織化學(xué)法研究Survivin在肝癌組織中表達以探討Survivin與肝癌關(guān)系對患者診療具有重要意義。本研究中不同剪切波速度患者癌組織中Survivin表達量結(jié)果顯示，高剪切波速度組織中Survivin表達量相對于低剪切波速度組織較高，說明肝癌患者肝臟超聲剪切波速度水平越高，原癌基因表達量越高[32]。PTEN基因為新發(fā)現(xiàn)的多功能磷酸酶編碼抑癌基因，具有雙重磷酸酶活性。PTEN基因由數(shù)百個氨基酸組成，根據(jù)功能分為氨基端磷酸酶區(qū)、羧基端區(qū)、與脂質(zhì)結(jié)合的C2區(qū)三個功能區(qū)域。多項研究顯示，PTEN基因能調(diào)節(jié)細胞周期、抑制癌細胞生長轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并參與維護免疫系統(tǒng)穩(wěn)定。PTEN對調(diào)控機制尚不明確，大多學(xué)者認為是通過三磷脂酰肌醇、絲裂原活化蛋白激酶及灶性粘連酶三種途徑進行。PTEN基因突變、甲基化、缺失為其抑制腫瘤細胞生長功能喪失，進而使肝癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤發(fā)生[33]。近年來較多學(xué)者嘗試通過基因工程方式將野生型PTEN導(dǎo)入癌細胞中，成功抑制腫瘤生長轉(zhuǎn)移。故研究PTEN基因在肝癌細胞中表達能為肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

綜上所述，肝癌患者肝臟超聲剪切波速度水平較高，且該水平與病灶內(nèi)血管新生因子VEGF、MMP-9水平和Survivin表達量呈正相關(guān)，與PTEN表達量呈負相關(guān)。