6種家畜乳脂肪SFC-Q-TOF-MS指紋特征及建?？尚行?/h1>
2022-05-19 07:10:12許昀暉郭軍劉宇婷劉莉敏郭保民
中國(guó)乳品工業(yè) 2022年4期 關(guān)鍵詞：物種
許昀暉，郭軍，劉宇婷，劉莉敏，郭保民
（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，呼和浩特010031）
0 引言
特種家畜乳[1-6]價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛乳，極易被摻假和冒充[7]。食品完整性（Food Integrity）和食品真實(shí)性（Food Authenticity）正在逐步成為國(guó)際食品貿(mào)易新的市場(chǎng)準(zhǔn)入準(zhǔn)則和新的技術(shù)壁壘[8]，特種家畜乳指紋特征和真實(shí)性鑒別研究開(kāi)發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。超臨界流體色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（SFC-Q-TOFMS）是利用超臨界流體CO2作為流動(dòng)相的新型色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，具有分離效率高、省時(shí)和環(huán)保等優(yōu)勢(shì)[9-12]，是鑒定化合物分子結(jié)構(gòu)的理想工具，但直接利用其質(zhì)譜圖指紋數(shù)據(jù)建模未見(jiàn)報(bào)道。乳脂肪95%以上為T(mén)AGs，易被非極性溶劑正己烷提取[9,13]，本研究旨在探索乳脂肪正己烷提取物SFC-Q-TOF-M S質(zhì)譜指紋數(shù)據(jù)，評(píng)價(jià)不經(jīng)過(guò)TAGs分子鑒定而直接建立家畜乳真實(shí)性快速質(zhì)譜判別模型的可行性。
1 材料與方法
1.1 材料
系統(tǒng)采集代表性乳樣56份，每份采集自一個(gè)牧場(chǎng)。荷斯坦牛乳6份（有機(jī)牧場(chǎng)3份，非有機(jī)舍飼牧場(chǎng)3份），山羊乳5份，牦牛乳5份，水牛乳5份，原馬乳10份，酸馬乳10份，雙峰駝乳15份。樣品在采集現(xiàn)場(chǎng)液氮冷卻，置于-20℃以下冷凍運(yùn)輸和保藏，樣品室溫解凍并均質(zhì)處理后取樣檢測(cè)。
1.2 試劑
正己烷、甲酸（色譜純），美國(guó)Fisher公司；甲醇、乙腈（質(zhì)譜純），美國(guó)Fisher公司；高純二氧化碳（純度≥99.999%），北京如源如泉科技有限公司。
1.3 儀器
超臨界流體色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SFCQ-TOF-MS，型號(hào)XevoRG2-S Q-TOF-MS，電離源Z-spray，采集模式ESI+），沃特世；T18均質(zhì)機(jī)，IKA；P型移液器（1000,100,10μL），法國(guó)Gilson公司。
1.4 方法
1.4.1 乳脂肪的萃取
準(zhǔn)確量取100μL乳樣于10 mL塑料離心管中，加入2 mL正己烷在室溫下渦旋震蕩2 min，然后放入離心機(jī)中以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，靜置分層，吸取約1 mL上清液，過(guò)0.22μm尼龍濾膜至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。
1.4.2 質(zhì)譜采集
色譜柱型號(hào)Acquity UPC2BEH-2EP(100 mm×3.0 mm×1.7μm)；流動(dòng)相：A相為超臨界CO2，B相為甲醇-乙腈-甲酸溶液體積比250∶250∶1；流速1.0 m L/min；柱溫50℃；樣品室溫度10℃；樣品進(jìn)樣量1μL；背壓1.1×104k Pa；流動(dòng)相梯度洗脫程序0~2 min保持0.1%B，之后4 min內(nèi)由0.1%B線性升至1%B，再在3 min內(nèi)線性升至2%B，保持6 min，接下來(lái)的5 min內(nèi)由2%B線性升至7%B，再在4 min內(nèi)線性升至20%B，在0.5 min內(nèi)返回初始流動(dòng)相比例0.1%B，并保持1 min；整個(gè)數(shù)據(jù)采集過(guò)程持續(xù)25 min。
電噴霧電離源正離子模式（ESI+），在全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）模式下采集質(zhì)量范圍為m/z 50~1 200范圍內(nèi)的物質(zhì)（數(shù)據(jù)處理截取480~910 m/z質(zhì)量范圍）；用質(zhì)量濃度為400 ng/mL亮氨酸腦啡肽（LE）（m/z=556.2771 in ESI+）作為L(zhǎng)ock mass，流速為10μL/min，掃描間隔為30 s；毛細(xì)管電壓為3.0 k V；錐孔電壓為25 V；錐孔氣流量20 L/h；離子源溫度120℃；脫溶劑氣為氮?dú)猓髁?00 L/h；碰撞氣為氬氣；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20~60 eV；原始數(shù)據(jù)采集軟件為Waters UNIFI。
1.5 質(zhì)譜分析
原始數(shù)據(jù)經(jīng)Waters Masslynx 4.1軟件降噪、基線校正和特征峰提取和對(duì)齊等前處理，獲得總基峰色譜圖（BPI），肉眼觀察比較整體形態(tài)和各峰形態(tài)數(shù)量、保留時(shí)間等特征。每個(gè)樣品BPI圖截取保留時(shí)間5~14 min段所包含的質(zhì)譜，用Waters Markerlynx XS進(jìn)行預(yù)處理，質(zhì)量窗口為20 mu；保留時(shí)間窗口為0.5 min；強(qiáng)度閾值為10 000 N/m2；5%峰高的峰寬為1.00 s；除燥程度為6.00，獲得本研究后續(xù)研究用的總質(zhì)譜圖。
這樣截取的總質(zhì)譜圖包含3 000~4 000多個(gè)質(zhì)譜峰，用Markerlynx XS以乳脂肪甘油三酯（TAGs）總體分子離子質(zhì)譜范圍橫向截留480~910 m/z，縱向截留相對(duì)豐度10%，20%，30%，50%范圍的質(zhì)譜范圍，導(dǎo)入化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Pirouette 4.5（美國(guó)Infometrix公司）進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），觀察乳樣以各分類(lèi)變量聚類(lèi)特征。PCA分析數(shù)據(jù)預(yù)處理方法有Mean-center（均值中心化）和Autoscale（標(biāo)準(zhǔn)化）。結(jié)果報(bào)道最優(yōu)質(zhì)譜截取的結(jié)果，即縱向截留30%質(zhì)譜峰進(jìn)行的PCA分析結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
2.1 總基峰色譜圖
6種家畜乳正己烷提取物的總基峰色譜圖（BPI）保留時(shí)間為0~25 min，每個(gè)物種代表性BPI如圖1所示。由圖1可以看出，不同物種之間的色譜圖有明顯的形態(tài)差異。牛乳、牦牛乳和水牛乳3種色譜峰整體形狀近似，均呈雙峰狀分布且有相似的峰群，出峰時(shí)間均集中在6~12 min；其他3物種乳基峰色譜圖整體呈單峰狀，出峰位置和各小峰復(fù)雜程度均有明顯的物種差異；山羊乳的色譜峰數(shù)量最多且密集，出峰時(shí)間集中在5~12 min。原馬乳和酸馬乳的色譜峰形狀相似且出峰時(shí)間最長(zhǎng)，集中在5~14.5 min。雙峰駝乳的色譜峰數(shù)量最少且出峰時(shí)間較短，主要集中在8~12.5 min。由圖可以看出不同家畜乳的BPI圖的形態(tài)、數(shù)量和出峰時(shí)間具有顯著的差異，這提示色譜指紋用于物種真實(shí)性判別有很大潛力。但是每個(gè)物種各乳樣總基峰色譜圖形狀十分接近，肉眼不好判別。BPI圖截取保留時(shí)間4~15 min段，做進(jìn)一步分析。
圖1 6種家畜乳正己烷提取物總基峰色譜（BPI）
2.2 總質(zhì)譜圖
6種家畜乳的正己烷提取物在MSE模式下獲得的分子離子峰[M+NH4]+保留時(shí)間4~15 min段BPI圖對(duì)應(yīng)的總質(zhì)譜圖，根據(jù)乳T(mén)AGs分子離子質(zhì)荷比范圍，橫軸截?。╩/z）480~910段，縱軸截取相對(duì)豐度大于30%的質(zhì)譜圖，結(jié)果如圖2所示。每個(gè)物種每個(gè)樣品質(zhì)譜峰數(shù)量成千上萬(wàn)，無(wú)法肉眼分辨。將所有樣品質(zhì)譜圖，即“質(zhì)譜指紋”導(dǎo)出為數(shù)據(jù)矩陣，再借助化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行進(jìn)一步的分析處理與判別。
圖2 6種家禽乳正乙烷提取物截取的總質(zhì)譜
2.3 質(zhì)譜指紋特征
2.3.1 6種家畜乳總質(zhì)譜指紋PCA分析
6種家畜乳總質(zhì)譜指紋PCA分析結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，不同家畜乳樣品在3D空間內(nèi)分別聚類(lèi)，且聚類(lèi)簇的距離遠(yuǎn)近符合物種分類(lèi)學(xué)關(guān)系。牛、牦牛、水牛和山羊同屬?？?，4者在三維空間聚集一處，共同分布于主成分2上方，但相互之間存在明顯的分離趨勢(shì)和單獨(dú)聚類(lèi)特征，山羊乳位于主因子2的右側(cè)單獨(dú)聚類(lèi)，牛乳、牦牛乳和水牛乳位于主因子2的左側(cè)，聚類(lèi)簇樣品點(diǎn)集中，在物種分類(lèi)學(xué)上[15]，牛和牦牛同屬牛科牛屬，山羊?qū)儆谂？粕窖驅(qū)伲Ｈ?、牦牛乳和水牛乳距離較山羊乳遠(yuǎn)，符合其物種分類(lèi)學(xué)特征。原馬乳和酸馬乳在3D空間內(nèi)聚集一處，少部分有膠著，但二者之間存在明顯的分離趨勢(shì)。雙峰駝乳在三維空間內(nèi)單獨(dú)聚類(lèi)，與其他物種家畜乳距離較遠(yuǎn)?？傊煌锓N乳脂肪質(zhì)譜指紋極為不同，利用家畜乳正己烷提取物質(zhì)譜指紋特征建立物種真實(shí)性判別模型可行。
圖3 6種家畜乳總質(zhì)譜指紋PCA得分向量
2.3.2 ?？萍倚笕榭傎|(zhì)譜指紋PCA分析
對(duì)?？频?種家畜乳（牛、牦牛、水牛和山羊乳）單獨(dú)進(jìn)行PCA分析結(jié)果如圖4所示。PCA得分向量圖顯示4種家畜乳在三維空間分別聚類(lèi)且分離趨勢(shì)明顯，水牛乳位于分割線右上方，牛、牦牛和山羊乳位于分割線左下方且分別單獨(dú)聚類(lèi)，聚類(lèi)簇樣品點(diǎn)集中，在物種分類(lèi)學(xué)上[15]，牛和牦牛同屬?？婆?，山羊?qū)儆谂？粕窖驅(qū)?，水牛屬于?？扑伲恼哌M(jìn)行PCA分析時(shí)，分別投射到三維空間內(nèi)聚類(lèi)也有明顯的體現(xiàn)，牛乳和牦牛乳距離較水牛乳和山羊乳距離遠(yuǎn)，符合其物種分類(lèi)學(xué)特征。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有機(jī)和非有機(jī)牛乳單獨(dú)聚類(lèi)且有明顯的分離趨勢(shì)。與張?chǎng)蝃14]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)和非有機(jī)牛乳脂肪酸（Fatty Acid，F(xiàn)As）指紋特征存在差異，二者PCA分析有明顯分離趨勢(shì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究并建立不同飼養(yǎng)模式下的家畜乳真實(shí)性判別模型。
圖4 ?？瓶傎|(zhì)譜指紋PCA得分向量
2.3.3 原馬乳和酸馬乳總質(zhì)譜指紋PCA分析
對(duì)原馬乳和酸馬乳的正己烷提取物總質(zhì)譜指紋進(jìn)行PCA分析，由圖5可以看出，二者分布于三維空間內(nèi)的不同相區(qū)，酸馬乳分布于主成分1下方且聚類(lèi)簇樣品點(diǎn)集中，原馬乳呈條狀單獨(dú)聚類(lèi)于三維空間內(nèi)一處，二者之間有明顯的分離趨勢(shì)。說(shuō)明原馬乳和酸馬乳之間的質(zhì)譜指紋存在明顯特征差異，提示質(zhì)譜指紋可用于家畜乳不同加工模式下的乳真實(shí)性鑒別。
圖5 原馬乳和酸馬乳總質(zhì)譜指紋PCA得分向量
3 討論
本研究首次對(duì)6種家畜乳脂肪的正己烷提取物SFC-Q-TOF-MS質(zhì)譜指紋進(jìn)行了直接比較和PCA聚類(lèi)特征研究。乳脂肪95%以上為甘油三酯（TAGs），容易被正己烷提取[13]，因此本研究探討的主要是乳脂肪TAGs的質(zhì)譜。但鑒定TAGs分子結(jié)構(gòu)是具有相當(dāng)復(fù)雜性和挑戰(zhàn)性，且非常耗時(shí)的一項(xiàng)工作[9,16]。在實(shí)踐中判別特種家畜乳真實(shí)性應(yīng)該力求簡(jiǎn)潔快速。本研究旨在研究乳脂肪的質(zhì)譜指紋特征，從而尋求直接利用乳脂肪質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立家畜乳真實(shí)性的判別模型。利用質(zhì)譜指紋建立乳的真實(shí)性判別模型可達(dá)快捷的目的。
結(jié)果表明正己烷提取乳脂肪的總基峰色譜圖（BPI）直觀地判別和區(qū)分不同家畜乳之間的差別，說(shuō)明利用BPI圖進(jìn)行肉眼鑒別具有一定的可行性，適于少量樣品的初步判別，但這不適合大量樣品的比對(duì)和判別，顯然利用現(xiàn)代軟件分析技術(shù)會(huì)更穩(wěn)健可靠。
MS圖比BPI圖復(fù)雜得多，無(wú)法用肉眼直接對(duì)比判別，但顯然其中隱藏的信息和規(guī)律也很多，因此對(duì)其探索分析研究的空間也很大。根據(jù)劉宇婷[16]等鑒定具體甘油三酯的相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)總體分子離子質(zhì)譜范圍橫向截留480~910 m/z，去除雜質(zhì)分子及碎片后借助化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和聚類(lèi)分析。本研究用PCA分析模塊，直觀地發(fā)現(xiàn)了乳脂肪正己烷提取物的質(zhì)譜指紋具有顯著的物種分類(lèi)學(xué)特征，完全可用于乳品物種真實(shí)性和其他方面真實(shí)性的判別模型的建立和應(yīng)用本研究發(fā)現(xiàn)的乳脂肪質(zhì)譜指紋的物種差異，可為乳品真實(shí)性判別研究提供新的思路。乳的質(zhì)譜指紋特征受多種因素共同作用和影響，除了物種之間的差異，其他因素如飼養(yǎng)模式、加工方式以及產(chǎn)地自然氣候和地理?xiàng)l件也會(huì)對(duì)乳脂肪造成影響，因此今后應(yīng)加大樣本量、豐富乳脂肪質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以期建立十分穩(wěn)健的家畜乳真實(shí)性質(zhì)譜指紋判別模型。另外今后也可探討利用乳脂肪的質(zhì)譜指紋鑒別飼養(yǎng)模式、加工方法和產(chǎn)地來(lái)源模型的可行性。
4 結(jié)論
家畜乳脂肪正己烷提取物的總基峰色譜圖（BPI）的形態(tài)、數(shù)量和出峰時(shí)間均有明顯的差異；利用乳脂肪質(zhì)譜指紋建立家畜乳真實(shí)性判別模型可行，至少可建立物種真實(shí)性判別模型。也有望建立不同飼養(yǎng)模式，如有機(jī)和非有機(jī)飼養(yǎng)的判別。本研究對(duì)家畜乳進(jìn)行全面的ESI+質(zhì)譜掃描和分析，從獨(dú)特的角度分析了家畜乳的差異，為乳品真實(shí)性鑒定提供創(chuàng)新思路和理論依據(jù)，同時(shí)也為繼續(xù)研究提供了大量思路和手段參考。
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1 材料與方法
1.1 材料
系統(tǒng)采集代表性乳樣56份，每份采集自一個(gè)牧場(chǎng)。荷斯坦牛乳6份（有機(jī)牧場(chǎng)3份，非有機(jī)舍飼牧場(chǎng)3份），山羊乳5份，牦牛乳5份，水牛乳5份，原馬乳10份，酸馬乳10份，雙峰駝乳15份。樣品在采集現(xiàn)場(chǎng)液氮冷卻，置于-20℃以下冷凍運(yùn)輸和保藏，樣品室溫解凍并均質(zhì)處理后取樣檢測(cè)。
1.2 試劑
正己烷、甲酸（色譜純），美國(guó)Fisher公司；甲醇、乙腈（質(zhì)譜純），美國(guó)Fisher公司；高純二氧化碳（純度≥99.999%），北京如源如泉科技有限公司。
1.3 儀器
超臨界流體色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（SFCQ-TOF-MS，型號(hào)XevoRG2-S Q-TOF-MS，電離源Z-spray，采集模式ESI+），沃特世；T18均質(zhì)機(jī)，IKA；P型移液器（1000,100,10μL），法國(guó)Gilson公司。
1.4 方法
1.4.1 乳脂肪的萃取
準(zhǔn)確量取100μL乳樣于10 mL塑料離心管中，加入2 mL正己烷在室溫下渦旋震蕩2 min，然后放入離心機(jī)中以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，靜置分層，吸取約1 mL上清液，過(guò)0.22μm尼龍濾膜至進(jìn)樣瓶中進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。
1.4.2 質(zhì)譜采集
色譜柱型號(hào)Acquity UPC2BEH-2EP(100 mm×3.0 mm×1.7μm)；流動(dòng)相：A相為超臨界CO2，B相為甲醇-乙腈-甲酸溶液體積比250∶250∶1；流速1.0 m L/min；柱溫50℃；樣品室溫度10℃；樣品進(jìn)樣量1μL；背壓1.1×104k Pa；流動(dòng)相梯度洗脫程序0~2 min保持0.1%B，之后4 min內(nèi)由0.1%B線性升至1%B，再在3 min內(nèi)線性升至2%B，保持6 min，接下來(lái)的5 min內(nèi)由2%B線性升至7%B，再在4 min內(nèi)線性升至20%B，在0.5 min內(nèi)返回初始流動(dòng)相比例0.1%B，并保持1 min；整個(gè)數(shù)據(jù)采集過(guò)程持續(xù)25 min。
電噴霧電離源正離子模式（ESI+），在全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）模式下采集質(zhì)量范圍為m/z 50~1 200范圍內(nèi)的物質(zhì)（數(shù)據(jù)處理截取480~910 m/z質(zhì)量范圍）；用質(zhì)量濃度為400 ng/mL亮氨酸腦啡肽（LE）（m/z=556.2771 in ESI+）作為L(zhǎng)ock mass，流速為10μL/min，掃描間隔為30 s；毛細(xì)管電壓為3.0 k V；錐孔電壓為25 V；錐孔氣流量20 L/h；離子源溫度120℃；脫溶劑氣為氮?dú)猓髁?00 L/h；碰撞氣為氬氣；低碰撞能量4 eV，高碰撞能量20~60 eV；原始數(shù)據(jù)采集軟件為Waters UNIFI。
1.5 質(zhì)譜分析
原始數(shù)據(jù)經(jīng)Waters Masslynx 4.1軟件降噪、基線校正和特征峰提取和對(duì)齊等前處理，獲得總基峰色譜圖（BPI），肉眼觀察比較整體形態(tài)和各峰形態(tài)數(shù)量、保留時(shí)間等特征。每個(gè)樣品BPI圖截取保留時(shí)間5~14 min段所包含的質(zhì)譜，用Waters Markerlynx XS進(jìn)行預(yù)處理，質(zhì)量窗口為20 mu；保留時(shí)間窗口為0.5 min；強(qiáng)度閾值為10 000 N/m2；5%峰高的峰寬為1.00 s；除燥程度為6.00，獲得本研究后續(xù)研究用的總質(zhì)譜圖。
這樣截取的總質(zhì)譜圖包含3 000~4 000多個(gè)質(zhì)譜峰，用Markerlynx XS以乳脂肪甘油三酯（TAGs）總體分子離子質(zhì)譜范圍橫向截留480~910 m/z，縱向截留相對(duì)豐度10%，20%，30%，50%范圍的質(zhì)譜范圍，導(dǎo)入化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Pirouette 4.5（美國(guó)Infometrix公司）進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），觀察乳樣以各分類(lèi)變量聚類(lèi)特征。PCA分析數(shù)據(jù)預(yù)處理方法有Mean-center（均值中心化）和Autoscale（標(biāo)準(zhǔn)化）。結(jié)果報(bào)道最優(yōu)質(zhì)譜截取的結(jié)果，即縱向截留30%質(zhì)譜峰進(jìn)行的PCA分析結(jié)果。
2 結(jié)果與分析
2.1 總基峰色譜圖
6種家畜乳正己烷提取物的總基峰色譜圖（BPI）保留時(shí)間為0~25 min，每個(gè)物種代表性BPI如圖1所示。由圖1可以看出，不同物種之間的色譜圖有明顯的形態(tài)差異。牛乳、牦牛乳和水牛乳3種色譜峰整體形狀近似，均呈雙峰狀分布且有相似的峰群，出峰時(shí)間均集中在6~12 min；其他3物種乳基峰色譜圖整體呈單峰狀，出峰位置和各小峰復(fù)雜程度均有明顯的物種差異；山羊乳的色譜峰數(shù)量最多且密集，出峰時(shí)間集中在5~12 min。原馬乳和酸馬乳的色譜峰形狀相似且出峰時(shí)間最長(zhǎng)，集中在5~14.5 min。雙峰駝乳的色譜峰數(shù)量最少且出峰時(shí)間較短，主要集中在8~12.5 min。由圖可以看出不同家畜乳的BPI圖的形態(tài)、數(shù)量和出峰時(shí)間具有顯著的差異，這提示色譜指紋用于物種真實(shí)性判別有很大潛力。但是每個(gè)物種各乳樣總基峰色譜圖形狀十分接近，肉眼不好判別。BPI圖截取保留時(shí)間4~15 min段，做進(jìn)一步分析。
圖1 6種家畜乳正己烷提取物總基峰色譜（BPI）
2.2 總質(zhì)譜圖
6種家畜乳的正己烷提取物在MSE模式下獲得的分子離子峰[M+NH4]+保留時(shí)間4~15 min段BPI圖對(duì)應(yīng)的總質(zhì)譜圖，根據(jù)乳T(mén)AGs分子離子質(zhì)荷比范圍，橫軸截?。╩/z）480~910段，縱軸截取相對(duì)豐度大于30%的質(zhì)譜圖，結(jié)果如圖2所示。每個(gè)物種每個(gè)樣品質(zhì)譜峰數(shù)量成千上萬(wàn)，無(wú)法肉眼分辨。將所有樣品質(zhì)譜圖，即“質(zhì)譜指紋”導(dǎo)出為數(shù)據(jù)矩陣，再借助化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行進(jìn)一步的分析處理與判別。
圖2 6種家禽乳正乙烷提取物截取的總質(zhì)譜
2.3 質(zhì)譜指紋特征
2.3.1 6種家畜乳總質(zhì)譜指紋PCA分析
6種家畜乳總質(zhì)譜指紋PCA分析結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，不同家畜乳樣品在3D空間內(nèi)分別聚類(lèi)，且聚類(lèi)簇的距離遠(yuǎn)近符合物種分類(lèi)學(xué)關(guān)系。牛、牦牛、水牛和山羊同屬?？?，4者在三維空間聚集一處，共同分布于主成分2上方，但相互之間存在明顯的分離趨勢(shì)和單獨(dú)聚類(lèi)特征，山羊乳位于主因子2的右側(cè)單獨(dú)聚類(lèi)，牛乳、牦牛乳和水牛乳位于主因子2的左側(cè)，聚類(lèi)簇樣品點(diǎn)集中，在物種分類(lèi)學(xué)上[15]，牛和牦牛同屬牛科牛屬，山羊?qū)儆谂？粕窖驅(qū)伲Ｈ?、牦牛乳和水牛乳距離較山羊乳遠(yuǎn)，符合其物種分類(lèi)學(xué)特征。原馬乳和酸馬乳在3D空間內(nèi)聚集一處，少部分有膠著，但二者之間存在明顯的分離趨勢(shì)。雙峰駝乳在三維空間內(nèi)單獨(dú)聚類(lèi)，與其他物種家畜乳距離較遠(yuǎn)?？傊煌锓N乳脂肪質(zhì)譜指紋極為不同，利用家畜乳正己烷提取物質(zhì)譜指紋特征建立物種真實(shí)性判別模型可行。
圖3 6種家畜乳總質(zhì)譜指紋PCA得分向量
2.3.2 ?？萍倚笕榭傎|(zhì)譜指紋PCA分析
對(duì)?？频?種家畜乳（牛、牦牛、水牛和山羊乳）單獨(dú)進(jìn)行PCA分析結(jié)果如圖4所示。PCA得分向量圖顯示4種家畜乳在三維空間分別聚類(lèi)且分離趨勢(shì)明顯，水牛乳位于分割線右上方，牛、牦牛和山羊乳位于分割線左下方且分別單獨(dú)聚類(lèi)，聚類(lèi)簇樣品點(diǎn)集中，在物種分類(lèi)學(xué)上[15]，牛和牦牛同屬?？婆?，山羊?qū)儆谂？粕窖驅(qū)?，水牛屬于?？扑伲恼哌M(jìn)行PCA分析時(shí)，分別投射到三維空間內(nèi)聚類(lèi)也有明顯的體現(xiàn)，牛乳和牦牛乳距離較水牛乳和山羊乳距離遠(yuǎn)，符合其物種分類(lèi)學(xué)特征。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有機(jī)和非有機(jī)牛乳單獨(dú)聚類(lèi)且有明顯的分離趨勢(shì)。與張?chǎng)蝃14]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)和非有機(jī)牛乳脂肪酸（Fatty Acid，F(xiàn)As）指紋特征存在差異，二者PCA分析有明顯分離趨勢(shì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究并建立不同飼養(yǎng)模式下的家畜乳真實(shí)性判別模型。
圖4 ?？瓶傎|(zhì)譜指紋PCA得分向量
2.3.3 原馬乳和酸馬乳總質(zhì)譜指紋PCA分析
對(duì)原馬乳和酸馬乳的正己烷提取物總質(zhì)譜指紋進(jìn)行PCA分析，由圖5可以看出，二者分布于三維空間內(nèi)的不同相區(qū)，酸馬乳分布于主成分1下方且聚類(lèi)簇樣品點(diǎn)集中，原馬乳呈條狀單獨(dú)聚類(lèi)于三維空間內(nèi)一處，二者之間有明顯的分離趨勢(shì)。說(shuō)明原馬乳和酸馬乳之間的質(zhì)譜指紋存在明顯特征差異，提示質(zhì)譜指紋可用于家畜乳不同加工模式下的乳真實(shí)性鑒別。
圖5 原馬乳和酸馬乳總質(zhì)譜指紋PCA得分向量
3 討論
本研究首次對(duì)6種家畜乳脂肪的正己烷提取物SFC-Q-TOF-MS質(zhì)譜指紋進(jìn)行了直接比較和PCA聚類(lèi)特征研究。乳脂肪95%以上為甘油三酯（TAGs），容易被正己烷提取[13]，因此本研究探討的主要是乳脂肪TAGs的質(zhì)譜。但鑒定TAGs分子結(jié)構(gòu)是具有相當(dāng)復(fù)雜性和挑戰(zhàn)性，且非常耗時(shí)的一項(xiàng)工作[9,16]。在實(shí)踐中判別特種家畜乳真實(shí)性應(yīng)該力求簡(jiǎn)潔快速。本研究旨在研究乳脂肪的質(zhì)譜指紋特征，從而尋求直接利用乳脂肪質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立家畜乳真實(shí)性的判別模型。利用質(zhì)譜指紋建立乳的真實(shí)性判別模型可達(dá)快捷的目的。
結(jié)果表明正己烷提取乳脂肪的總基峰色譜圖（BPI）直觀地判別和區(qū)分不同家畜乳之間的差別，說(shuō)明利用BPI圖進(jìn)行肉眼鑒別具有一定的可行性，適于少量樣品的初步判別，但這不適合大量樣品的比對(duì)和判別，顯然利用現(xiàn)代軟件分析技術(shù)會(huì)更穩(wěn)健可靠。
MS圖比BPI圖復(fù)雜得多，無(wú)法用肉眼直接對(duì)比判別，但顯然其中隱藏的信息和規(guī)律也很多，因此對(duì)其探索分析研究的空間也很大。根據(jù)劉宇婷[16]等鑒定具體甘油三酯的相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)總體分子離子質(zhì)譜范圍橫向截留480~910 m/z，去除雜質(zhì)分子及碎片后借助化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和聚類(lèi)分析。本研究用PCA分析模塊，直觀地發(fā)現(xiàn)了乳脂肪正己烷提取物的質(zhì)譜指紋具有顯著的物種分類(lèi)學(xué)特征，完全可用于乳品物種真實(shí)性和其他方面真實(shí)性的判別模型的建立和應(yīng)用本研究發(fā)現(xiàn)的乳脂肪質(zhì)譜指紋的物種差異，可為乳品真實(shí)性判別研究提供新的思路。乳的質(zhì)譜指紋特征受多種因素共同作用和影響，除了物種之間的差異，其他因素如飼養(yǎng)模式、加工方式以及產(chǎn)地自然氣候和地理?xiàng)l件也會(huì)對(duì)乳脂肪造成影響，因此今后應(yīng)加大樣本量、豐富乳脂肪質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以期建立十分穩(wěn)健的家畜乳真實(shí)性質(zhì)譜指紋判別模型。另外今后也可探討利用乳脂肪的質(zhì)譜指紋鑒別飼養(yǎng)模式、加工方法和產(chǎn)地來(lái)源模型的可行性。
4 結(jié)論
家畜乳脂肪正己烷提取物的總基峰色譜圖（BPI）的形態(tài)、數(shù)量和出峰時(shí)間均有明顯的差異；利用乳脂肪質(zhì)譜指紋建立家畜乳真實(shí)性判別模型可行，至少可建立物種真實(shí)性判別模型。也有望建立不同飼養(yǎng)模式，如有機(jī)和非有機(jī)飼養(yǎng)的判別。本研究對(duì)家畜乳進(jìn)行全面的ESI+質(zhì)譜掃描和分析，從獨(dú)特的角度分析了家畜乳的差異，為乳品真實(shí)性鑒定提供創(chuàng)新思路和理論依據(jù)，同時(shí)也為繼續(xù)研究提供了大量思路和手段參考。
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