劉青悅，張巖，劉杰，魏祥飛，曲波，姜毓君，王春梅，張莉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030)

0 引言

乳脂肪和乳蛋白是牛奶中重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，乳脂肪與乳蛋白的含量與組成是決定牛奶營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)[1]。非編碼RNAs(miRNAs)是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，參與了各種生物學(xué)過(guò)程，在動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。近幾年，miRNAs在奶牛乳腺發(fā)育和泌乳方面的研究也有一些進(jìn)展。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)乳合成相關(guān)蛋白基因的表達(dá)從而影響乳成分的合成與分泌[5-6]。miR-9-5p在哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在并參與多種細(xì)胞活動(dòng)和代謝過(guò)程，有研究證實(shí)miR-9-5p可以抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和人肥厚瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和分化[7-8]。目前關(guān)于miR-9-5p的研究主要集中在其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用方面，研究發(fā)現(xiàn)miR-9-5p可以抑制胰腺癌[9]、乳腺癌[10]、肝癌[11]等癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在高乳品質(zhì)和低乳品質(zhì)奶牛乳腺組織中的表達(dá)存在顯著差異，但是miR-9-5p在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的作用及作用機(jī)制尚不明確，所以本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

膠原酶IV，sigma；胎牛血清，BI；培養(yǎng)液干粉，胰酶，Giboc；LipofectaminceTM3000轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，Thermo Fisher；MTT溶液、Formazan，Sdartion。

1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的獲取與鑒定

使用膠原酶消化組織塊，分離得到奶牛乳腺上皮原代細(xì)胞(DCMECs)。將細(xì)胞置于含有10%血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)液中，并處于5%CO2、37℃無(wú)菌環(huán)境中培養(yǎng)。使用0.25%胰酶進(jìn)行純化去除成纖維細(xì)胞后，得到奶牛乳腺上皮細(xì)胞。采用免疫熒光染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18染色鑒定[12]。

1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-9-5p的過(guò)表達(dá)檢測(cè)

將狀態(tài)良好的奶牛乳腺上皮細(xì)胞均勻接種于6孔板中，并保持生長(zhǎng)密度一致。待細(xì)胞增長(zhǎng)至70%后使用轉(zhuǎn)染試劑(LipofectamineTM3000)向6孔板中轉(zhuǎn)染miRNA。miR-9-5p處理組：3μL Lip3000、100 nmol/L miR-9-5p mimics；陰性對(duì)照組：3μL Lip3000、100 nmol/L miR-9-5p NC。

1.4 miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖影響的檢測(cè)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中，計(jì)算每孔細(xì)胞數(shù)為3 000~10 000個(gè)細(xì)胞。置于37℃、5%CO2無(wú)菌環(huán)境培養(yǎng)6 h。分別向奶牛乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA和NC(每組處理3個(gè)重復(fù))，細(xì)胞在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，加入90μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸棄上清，每孔加入110μL Formazan溶解液。置搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值。

1.5 miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成的影響

分別用1 00 nmol/L的miR-9-5p mimics和NC處理細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞蛋白樣品，采用western blotting技術(shù)檢測(cè)乳脂合成相關(guān)信號(hào)通路蛋白SREBP1的表達(dá)變化。使用SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒配制凝膠，按說(shuō)明書操作。樣品電泳后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間90 min。之后進(jìn)行抗體孵育，一抗SREBP1(Santa Cruz)在4℃條件下過(guò)夜孵育，二抗(HRP-山羊抗兔IgG)在37℃條件下孵育2 h。一抗和二抗孵育完成后進(jìn)行顯色。蛋白條帶的顯色結(jié)果使用Sag Capture獲得，再通過(guò)軟件Image J讀取蛋白灰度值。

同樣，向6孔板中轉(zhuǎn)染mi R-9-5p mimics和NC，培養(yǎng)48 h后去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍細(xì)胞。每孔細(xì)胞中加入150μL RIPA裂解液，裂解后的樣品（1000~1500）g離心5 min取上清。使用甘油三酯酶聯(lián)測(cè)定試劑盒(普利萊)在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀562 nm處測(cè)量各孔的吸光度，并計(jì)算甘油三脂的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prim 8.0.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)并對(duì)多組進(jìn)行了單因素方差分析。p＜0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，p＜0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)使用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中角蛋白18的表達(dá)。如圖1所示，細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)周圍有大量的角蛋白18(綠色熒光)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離純化后得到的細(xì)胞為奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18的鑒定(400×)

2.2 miR-9-5p轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞

MiRNA處理細(xì)胞24 h后，提取各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)miRNA處理組(mi R-9-5p組)、陰性對(duì)照組(NC組)和空白細(xì)胞對(duì)照組(Control組)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)量變化情況如圖2所示。結(jié)果可見miR-9-5p組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)量顯著增高，且差異性極顯著(p＜0.01)。

圖2 miR-9-5p過(guò)表達(dá)后奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的miR-9-5p的表達(dá)水平

2.3 miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

為驗(yàn)證miR-9-5p是否會(huì)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)使用MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示mi R-9-5p顯著抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖(p＜0.01)。

圖3 miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

2.4 miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成的影響

2.4.1 miR-9-5p對(duì)乳脂合成信號(hào)通路蛋白SREBP1表達(dá)的影響

SREBP1是重要的乳脂合成信號(hào)通路蛋白，主要通過(guò)調(diào)控參與乳脂肪合成的多種酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞中甘油三脂的合成和分泌。為確定mi R-9-5p是否會(huì)影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SREBP1的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)使用western blotting技術(shù)分別檢測(cè)miRNA處理組和陰性對(duì)照組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SREBP1蛋白的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4可見，在miR-9-5p作用下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SREBP1蛋白的表達(dá)量顯著低于陰性對(duì)照組(p＜0.01)，說(shuō)明miR-9-5p會(huì)抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SREBP1的表達(dá)，并可能因此引起細(xì)胞中乳脂合成的下降。

圖4 miR-9-5p處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后SREBP1蛋白的表達(dá)量檢測(cè)

2.4.2 miR-9-5p對(duì)甘油三脂合成的影響

為進(jìn)一步確定miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成的影響，本實(shí)驗(yàn)使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別檢測(cè)了miRNA處理組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞中甘油三脂的含量(μmol/mL)變化情況。通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算兩組細(xì)胞中甘油三酯的含量。結(jié)果如圖5所示，與NC組相比，miR-9-5p組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯的含量明顯降低，且差異性極顯著(p＜0.01)，表明miR-9-5p能顯著抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂的合成。

圖5 miR-9-5p處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后甘油三脂含量的檢測(cè)

3 討論

miRNA是長(zhǎng)度大約21~25個(gè)核苷酸的一種短的、非編碼的RNA分子，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[13]。已有研究表明，miRNA參與了調(diào)控細(xì)胞增殖[7]、分化[14]和凋亡[15]等過(guò)程，并同糖代謝[16]、脂代謝[17]、蛋白質(zhì)代謝[18]及器官發(fā)育[19]等多種機(jī)體生命活動(dòng)密切相關(guān)。近年來(lái)，miRNA在動(dòng)物乳腺發(fā)育和乳成分代謝中的調(diào)控作用也不斷地被報(bào)道。2017年Lei等[20]報(bào)道了Let-7g-5p在小鼠乳腺中抑制β-酪蛋白的表達(dá)。張等[4]發(fā)現(xiàn)miR-3880過(guò)表達(dá)具有促進(jìn)小鼠乳腺細(xì)胞甘油三酯合成的作用。在牛乳腺上皮細(xì)胞中，研究人員發(fā)現(xiàn)miR-497通過(guò)調(diào)節(jié)LATS2的表達(dá)抑制甘油三酯和不飽和脂肪酸的產(chǎn)生，以此調(diào)控細(xì)胞的脂肪代謝[6]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(Sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1)是人和動(dòng)物乳脂肪合成的主要轉(zhuǎn)錄因子，它主要通過(guò)調(diào)控參與乳脂肪合成的多種酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)影響細(xì)胞中甘油三脂的合成和分泌[21]。有研究表明，miR-138-5p能抑制SREBP1的表達(dá)和穩(wěn)定性，從而抑制細(xì)胞脂質(zhì)代謝[22]。Lu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-212可調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶(FASN)和SREBP1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞中脂肪的生成。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-9-5p可以顯著抑制細(xì)胞的增殖，降低SREBP1蛋白的表達(dá)量，并且顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯的表達(dá)。近幾年許多研究表明SREBP1的合成與多個(gè)信號(hào)通路相關(guān)[24-26]。因此，miR-9-5p如何通過(guò)影響細(xì)胞增殖和SREBP1的表達(dá)影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

miR-9-5p能夠抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，降低乳脂合成調(diào)控蛋白SREBP1的表達(dá)，同時(shí)抑制甘油三酯的合成，表明miR-9-5p對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂合成具有抑制作用，并且可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖和下調(diào)SREBP1的表達(dá)發(fā)揮作用。