張宇，趙家源，鄭佳鵬，滿朝新，姜毓君

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150030)

0 引言

乳酸菌是一種重要的益生菌資源，其廣泛存在于自然界和發(fā)酵乳制品中。乳酸菌具有豐富的物種多樣性和功能性，副干酪乳桿菌作為代表性的乳酸菌，在食品、藥品、畜牧業(yè)、基因工程等多個(gè)領(lǐng)域被廣泛研究和應(yīng)用。其廣泛的益生功能被大量研究和臨床所證實(shí)，如緩解乳糖不耐癥、調(diào)控宿主腸道微生態(tài)、參與并調(diào)控宿主代謝、抵抗致病菌增強(qiáng)免疫力等[1]。每日補(bǔ)充性的攝入含乳酸菌的食物或乳酸菌制劑越來越被消費(fèi)者接受，但乳酸菌持續(xù)發(fā)揮益生功效主要依賴于其在腸道內(nèi)長期穩(wěn)定的定植[2]。一般來說，口服攝入的乳酸菌主要有兩個(gè)去向：一部分隨胃腸道消化蠕動或腸上皮細(xì)胞脫落排出體外；另一部分黏附在腸道某些部位成功定植[3]。乳酸菌定植腸道最直接的作用是為宿主腸道提供生物屏障，增強(qiáng)腸屏障功能[4]。黏附作為乳酸菌定植腸道的前提，黏附率是開發(fā)具有腸道定植潛力菌株的重要參考指標(biāo)，同時(shí)也是乳酸菌益生特性之一?，F(xiàn)有的研究揭示了黏附主要涉及到特異性黏附素和非特異性黏附素的作用，其中，胞外多糖是乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生的一種重要的特異性黏附素[5]。Zivkovic等人通過對比原生型產(chǎn)胞外多糖副干酪乳桿菌菌株和基因突變型不產(chǎn)胞外多糖副干酪乳桿菌菌株對Caco-2細(xì)胞的黏附率差異，證實(shí)了胞外多糖在腸道黏附中的作用[6]。胞外多糖不僅參與菌體結(jié)構(gòu)構(gòu)成，還是研究廣泛的后生元之一。研究表明胞外多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、優(yōu)化腸道菌群構(gòu)成、抑制致病菌生長、抗氧化、降血糖等多種益生功效[7]。同時(shí)，在食品加工中，胞外多糖因其獨(dú)特復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，可以賦予食品特殊優(yōu)良性狀，改善食品質(zhì)地[8]。乳酸菌不僅可以依靠黏附素達(dá)到定植的效果，其菌株自身的對胃腸液的耐受性是其基本的益生特性，乳酸菌依靠自身對腸道環(huán)境的耐受性，通過胃腸道的一系列物理和化學(xué)障礙到達(dá)腸道并在腸道中定植。因此，一株良好的功能性益生菌對宿主發(fā)揮有益作用的前提是能夠?qū)δM的人胃腸道條件具有良好的耐受性。

II型糖尿?。═ 2DM）是一種發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜的慢性代謝紊亂性疾病，以胰島素抵抗和胰島細(xì)胞損傷導(dǎo)致的慢性高血糖為主要特征[9]。傳統(tǒng)的糖尿病藥物（如雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等）成本高，毒副作用大，還伴隨不同程度的不適癥狀，不適合長期服用[10]。因此尋找新型的經(jīng)濟(jì)安全的糖尿病藥物具有重要意義。近年來，利用乳酸菌進(jìn)行糖尿病的預(yù)防與治療，不僅可以發(fā)揮乳酸菌本身的降血糖作用，同時(shí)還可以發(fā)揮乳酸菌其他的益生功能，對人體健康具有重要意義[11]。抑制α-葡萄糖苷酶的活性是調(diào)控糖尿病的主要方法之一，因此乳酸菌可能是通過抑制α-葡萄糖苷酶活性從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖的功能作用，所以體外具有高α-葡萄糖苷酶抑制活性的乳酸菌將是潛在的輔助抗糖尿病的益生菌株。

本研究以分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的副干酪乳桿菌JY062（原副干酪乳桿菌TD062）為試驗(yàn)菌株，通過胞外多糖產(chǎn)量測定，比較無胞外多糖菌株、有胞外多糖菌株對Caco-2細(xì)胞黏附性測定以及其對α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定，綜合各項(xiàng)測定指標(biāo)確定副干酪乳桿菌JY062是一株高產(chǎn)胞外多糖，且具有高黏附性能的降血糖功能性副干酪乳桿菌菌株，為安全、高效、無副作用的新型功能性產(chǎn)品的開發(fā)與研制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌株

從西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳中分離出的副干酪乳桿菌JY062(原副干酪乳桿菌TD 062)，保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。Caco-2細(xì)胞保存于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑與設(shè)備

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；α-葡萄糖苷酶、對硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（PNPG）、小牛血清、青霉素、鏈霉素、ConA液、無菌Hank's液、Tris-HCL緩沖液，北京索來寶生物科技有限公司。

冷凍高速離心機(jī)，德國Sigma有限公司；振蕩器，瑞士Mettler Toledo有限公司；加樣槍，美國Thermo公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀、分光光度計(jì)，美國Molecular Devices公司；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；高壓滅菌器，山東博科BIOBASE有限公司；低溫冰箱，美國Kaltis Merit有限公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 副干酪乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量的測定

37℃培養(yǎng)條件下，試驗(yàn)菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，在容量為1.0 L的三角瓶子中進(jìn)行分批發(fā)酵，接種物的初始密度約為1.5×109CFU/mL，接種物濃度為5.0%。粗胞外多糖按照水提醇沉法[12]進(jìn)行提取，采用三氯乙酸去除蛋白的方法[13]進(jìn)行純化，將去除蛋白的胞外多糖重懸于去離子水中，透析72 h（分子截流量為：12 000~14 000 u）。將上清液凍干，獲得胞外多糖樣品。然后對凍干后的胞外多糖樣品進(jìn)行稱重，并用苯酚-硫酸法測定副干酪乳桿菌JY062胞外多糖中的多糖含量。

1.2.2 菌株對腸道黏附力的測定

(1)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)。將液氮保存的Caco-2細(xì)胞取出，使用含20%胎牛血清且含雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液（過濾除菌）復(fù)蘇細(xì)胞，在37℃溫度條件下，5%CO2培養(yǎng)箱中至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中聚合度達(dá)到80%，隨后加入1 mL胰酶消化終止貼壁，收集細(xì)胞以105cells/mL的濃度接種于六孔板，加入含雙抗細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，每2天換一次液，在黏附試驗(yàn)前24 h將培養(yǎng)液換為無雙抗培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿細(xì)胞瓶狀態(tài)時(shí)即可進(jìn)行黏附試驗(yàn)。

(2)菌株黏附力測定。參照張紫薇的方法進(jìn)行黏附試驗(yàn)[14]，首先收集活化兩代，生長至對數(shù)末期的副干酪乳桿菌JY062的菌泥，4℃溫度條件下，12 000g，離心5 min，然后重懸于無雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液中，調(diào)整菌液濃度為108CFU/mL備用。倒掉細(xì)胞六孔板中的培養(yǎng)液，加入含菌的細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃條件下，5%CO2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2 h后使用無菌PBS緩沖液洗滌3次六孔板以除去未黏附的乳酸菌，加入胰酶消化收集貼壁細(xì)胞，迅速進(jìn)行梯度稀釋涂布，計(jì)數(shù)并計(jì)算黏附率。對照組是經(jīng)PBS清洗掉胞外多糖的副干酪乳桿菌JY062的菌泥，黏附率公式如下：

其中，Nt為黏附后的活菌數(shù)，N0為初始活菌數(shù)。

1.2.3 體外降血糖活性的測定

將副干酪乳桿菌JY062以5%接種量接種到普通MRS液體培養(yǎng)基中，傳代2次，37℃，18 h，在4℃，6 000g條件下離心8 min，吸取部分上清液，在無菌條件下用0.22μm的濾膜過濾，獲得無細(xì)胞上清液。按照Zeng的方法[15]略加改動進(jìn)行體外降血糖效果評價(jià)。首先將50μL的樣品和100μL，1 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液混勻，37℃孵育10 min，然后向混合物中加入50μL，5 mmol/L的PNPG溶液，混勻后，37℃反應(yīng)5 min，用酶標(biāo)儀測定405 nm處的吸光度。每組試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。其中，樣品的吸光度用樣品空白對照（體系中用100μL PBS（p H 6.8）代替α-葡萄糖苷酶）的吸光度進(jìn)行校準(zhǔn)。陰性對照（體系中無抑制α-葡萄糖苷酶的樣品）用50μL PBS（p H 6.8）代替樣品，陰性空白對照（體系中沒有α-葡萄糖苷酶活性）用50μL PBS（p H值6.8）代替樣品，100μL PBS（p H 6.8）代替α-葡萄糖苷酶。α-葡萄糖苷酶抑制率的計(jì)算公式為:

其中，A為待測菌反應(yīng)組的吸光度值；B為待測菌對照組的吸光度值；C為空白反應(yīng)組的吸光度值；D為空白對照組的吸光度值。

1.2.4 體外耐受性評價(jià)

1.2.4.1 消化道環(huán)境耐受性-耐酸性

將鑒定純化后的副干酪乳桿菌JY062按照3%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)18 h（對數(shù)生長后期）。4℃，12 000g，離心5 min，吸出上清液獲得菌泥，隨后用無菌PBS緩沖液洗滌菌泥3次并重新懸浮緩沖液中。吸取菌懸液以3%的接種量接種于p H值為3.0的無菌液體MRS培養(yǎng)基，充分混勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至0、1、2和3 h時(shí)，再次混勻，分別吸取100μL菌液進(jìn)行梯度稀釋，隨后取各梯度的稀釋液分別在無菌固體MRS培養(yǎng)基上均勻涂布，37℃，培養(yǎng)48 h后取菌落數(shù)在30~300 CFU之間的平板精準(zhǔn)計(jì)數(shù)。存活率計(jì)算公式如下：

其中Nt為各時(shí)間點(diǎn)的菌落數(shù)，N0為初始點(diǎn)的菌落數(shù)。

1.2.4.2 消化道環(huán)境耐受性-耐人工胃腸液

分別配制人工胃液和腸液：將胃蛋白酶溶于p H為3.0的PBS無菌緩沖液，調(diào)整胃蛋白酶濃度為3 g/L，為模擬胃液；將胰蛋白酶溶解于p H為8.0的PBS無菌緩沖液，調(diào)整胰蛋白酶濃度為1 g/L，為模擬腸液。隨后，分別使用無菌濾膜（0.22μm）將模擬腸液和模擬胃液過濾除菌待用。菌懸液的處理和制備仍參考1.1耐酸性試驗(yàn)步驟，吸取菌懸液以3%的接種量接種于模擬胃液并混勻，37℃培養(yǎng)，分別于0、1、2和3 h時(shí)取100μL的菌液進(jìn)行稀釋涂布，計(jì)算存活率。隨后吸取1 m L培養(yǎng)至3 h的菌-胃液，加入9 m L無菌模擬腸液中混勻，37℃培養(yǎng)，并分別于1、3、5和8 h時(shí)吸取100μL菌液用于稀釋涂布，計(jì)算存活率。存活率計(jì)算公式同1.2.4.1公式。

1.2.4.3 耐膽鹽

參考1.2.4.1耐酸性試驗(yàn)的步驟，收集副干酪乳桿菌JY062的菌泥，經(jīng)洗滌后懸浮在無菌PBS緩沖液中。吸取菌懸液以3%的接種量接種于含0.3%膽酸鹽的無菌液體MRS培養(yǎng)基中并充分混勻，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至0、1、2、3和4 h時(shí)混勻體系，分別吸取100μL菌液進(jìn)行梯度稀釋，計(jì)算存活率。存活率計(jì)算公式同1.2.4.1公式。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin軟件、Excel軟件和GraphPad Prism 8.02進(jìn)行繪圖分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖產(chǎn)量的測定

本試驗(yàn)測定了副干酪乳桿菌JY062（原副干酪乳桿菌TD062）的胞外多糖產(chǎn)量及多糖含量，如表1所示。從表中可以看出，分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的副干酪乳桿菌JY062表現(xiàn)出很好的產(chǎn)胞外多糖的能力，其胞外多糖產(chǎn)量為0.609 g/L。通過相關(guān)研究表明，不同乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的能力存在明顯差異，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量范圍在25~600 mg/L之間[16]。通過對比分析，發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌JY062的胞外多糖產(chǎn)量在合理范圍內(nèi)。通過本研究對比相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量差異性不僅存在于不同的菌種，還存在于不同的菌株。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）計(jì)算副干酪乳桿菌JY062胞外多糖的多糖含量，如表1所示，副干酪乳桿菌JY062的胞外多糖中多糖為90.57μg/mL。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1副干酪乳桿菌JY062（原副干酪乳桿菌TD062）胞外多糖產(chǎn)量及多糖含量

2.2 菌株黏附力評價(jià)

如圖2所示，副干酪乳桿菌JY062對Caco-2細(xì)胞的黏附力?？梢钥闯?，未經(jīng)清洗掉胞外多糖的副干酪乳桿菌JY062對Caco-2細(xì)胞的黏附率最高，達(dá)到91.2%，清洗掉保外多糖的菌株的黏附性能也較高，黏附率為54.37%。表明副干酪乳桿菌JY062是一株高黏附性菌株，且其分泌的胞外多糖顯著提高其黏附性能。乳酸菌在宿主腸道內(nèi)的黏附定植是其持續(xù)發(fā)揮益生作用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，也是腸道定植工作需要優(yōu)先考慮的指標(biāo)之一[17]。這是因?yàn)?，益生菌在腸道的定植至關(guān)重要，益生菌的長期定植可以為宿主提供穩(wěn)固的生物屏障[18]，同時(shí)增強(qiáng)腸屏障功能[19]、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)[20]、調(diào)節(jié)短鏈脂肪酸等代謝物的產(chǎn)生[21]。且副干酪乳桿菌JY062分泌的胞外多糖能夠顯著提高其黏附定植的能力，表明該菌株能夠以胞外多糖為黏附素，定植宿主腸道，發(fā)揮其益生功能作用。

2.3 菌株體外降血糖評價(jià)

α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前臨床治療T 2DM的常用藥物，可通過抑制α-葡萄糖苷酶分解多糖為葡萄糖的作用減緩葡萄糖的吸收速度從而降低血糖水平[22]。而PNPG是一種麥芽糖的類似物，能夠被α-葡萄糖苷酶分解為對硝基苯酚，可通過檢測對硝基苯酚的吸光度值計(jì)算樣品中各抑制劑的抑制率[23]。因此，本試驗(yàn)利用PNPG體外評價(jià)方法對菌株無細(xì)胞上清液的抑制率進(jìn)行比較，結(jié)果如圖所示。由表2可以看出，副干酪乳桿菌JY062對α-葡萄糖苷酶具有抑制作用，抑制率達(dá)到57.36%，這也說明了副干酪乳桿菌JY062具有體外降血糖能力。張歡歡等人對接入植物乳桿菌ST-III的豆?jié){溶液的研究中發(fā)現(xiàn)其α-葡萄糖苷酶抑制率為35.67%[24]，比本試驗(yàn)結(jié)果略高。白等人[25]在34株供試菌中篩選出干酪乳桿菌K11、副干酪乳桿菌J5、副干酪乳桿菌G15這3株乳桿菌表現(xiàn)出了與陽性對照組鼠李糖乳桿菌LGG相同的良好抑制α-葡萄糖苷酶的能力。除此之外，有研究證實(shí)，活性物質(zhì)如胞外多糖或γ-氨基丁酸可以降低血糖水平，緩解糖尿病癥狀[26]。因此初步猜測推測副干酪乳桿菌JY062這種α-葡萄糖苷酶抑制活性可能是由菌株產(chǎn)生的胞外多糖引起的。

圖2副干酪乳桿菌JY062(原副干酪乳桿菌TD062)對Caco-2細(xì)胞的黏附率

表2副干酪乳桿菌JY062（原副干酪乳桿菌TD062）對α-葡萄糖苷酶的抑制率

綜合副干酪乳桿菌JY062胞外多糖的產(chǎn)量、對Caco-2細(xì)胞的黏附性能以及對α-葡萄糖苷酶的抑制活性這3項(xiàng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)副干酪乳桿菌JY062的3項(xiàng)指標(biāo)都很突出，說明該菌株不但高產(chǎn)胞外多糖，還對Caco-2細(xì)胞具有很好的黏附性能，且該菌株具有體外降血糖活性。

2.4 消化道環(huán)境耐受性

2.4.1 副干酪乳桿菌JY062的耐酸性

副干酪乳桿菌JY062的耐酸性試驗(yàn)結(jié)果見圖3，由圖3可知，JY062在p H為3.0時(shí)，在3個(gè)小時(shí)的酸刺激下，存活率呈現(xiàn)下降趨勢，但經(jīng)過3個(gè)小時(shí)的酸刺激菌株仍能保持91.08%的高存活率，這表明副干酪乳桿菌JY 062具有較強(qiáng)的耐酸能力。研究表明，在非空腹?fàn)顟B(tài)下，正常人胃液pH在3.0左右，食物在胃中停留時(shí)間大約3 h[27]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，副干酪乳桿菌JY062可以適應(yīng)人體胃部強(qiáng)酸環(huán)境。

圖3副干酪乳桿菌JY062(原副干酪乳桿菌TD062)耐酸性結(jié)果

2.4.2 副干酪乳桿菌JY062的耐人工胃腸液性

副干酪乳桿菌JY062在人工胃腸液環(huán)境下的存活率見圖4和圖5可以看出，經(jīng)過連續(xù)的胃液和腸液消化，副干酪乳桿菌JY062的存活率呈現(xiàn)下降趨勢，經(jīng)3 h的胃液刺激后，菌株的存活率為91.27%，繼續(xù)轉(zhuǎn)入腸液消化8 h,菌株存活率為80.73%。結(jié)果表明，經(jīng)過長時(shí)間的胃腸液消化，副干酪乳桿菌JY062存活率雖然降低，但仍有大部分菌株存活。其中，胃腸液中的胃蛋白酶和胰蛋白酶是主要的影響因素，它們會對菌體蛋白成分產(chǎn)生分解作用，從而破壞菌株蛋白空間結(jié)構(gòu)，喪失生物功能[28]。副干酪乳桿菌JY062可以在消化酶的作用下多數(shù)存活，適應(yīng)胃腸道極端環(huán)境。

圖4副干酪乳桿菌JY062(原副干酪乳桿菌TD062)耐人工胃液結(jié)果

圖5副干酪乳桿菌JY062(原副干酪乳桿菌TD062)耐人工腸液結(jié)果

2.4.3副干酪乳桿菌JY062的耐膽鹽性

膽鹽對細(xì)菌的結(jié)構(gòu)有一定的破壞，進(jìn)而抑制細(xì)菌的生理活性，菌株對膽鹽的耐受能力強(qiáng)弱決定了菌株是否可以在腸道環(huán)境中存活，從而發(fā)揮其益生功能，研究表明人體小腸中的膽鹽濃度一般為0.3%左右[29]。如圖6顯示的是副干酪乳桿菌JY062在膽鹽脅迫下4 h的存活率?？梢钥闯觯诔掷m(xù)的膽鹽刺激下，副干酪乳桿菌JY062的存活率呈現(xiàn)下降趨勢，經(jīng)過4 h的處理，菌株存活率為85.45%。這表明副干酪乳桿菌對于膽鹽有較強(qiáng)的耐受力。

圖6副干酪乳桿菌JY062（原副干酪乳桿菌TD062）耐膽鹽結(jié)果

通過以上模擬人體消化道環(huán)境的試驗(yàn)，可以看出，副干酪乳桿菌JY062具有較高水平的環(huán)境耐受能力，而這種特性是口服益生菌不可缺少的，尤其是對于在存活狀態(tài)下發(fā)揮益生功能的菌株。這種特性保證了菌株能夠抵抗復(fù)雜的消化環(huán)境，得以存活并長時(shí)間發(fā)揮其益生功能。

3 結(jié)論

本研究通過測定分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的副干酪乳桿菌JY062（原副干酪乳桿菌TD062）產(chǎn)胞外多糖的能力、對Caco-2細(xì)胞的黏附能力以及PNPG體外降血糖方法，明確了副干酪乳桿菌JY062是一株高產(chǎn)胞外多糖、黏附性能突出，且具有體外降血糖活性的功能性益生菌。進(jìn)而，模擬人體胃腸道環(huán)境，評價(jià)副干酪乳桿菌JY062的體外耐受性，發(fā)現(xiàn)該菌株具有較高水平的環(huán)境耐受能力。因此，副干酪乳桿菌JY062不但可以通過自身對人體胃腸道環(huán)境良好的耐受性，定植在人體胃腸道，還可以其自身分泌的胞外多糖為黏附素，提高其在人體胃腸道定植的作用效果，從而發(fā)揮其降血糖的功能作用。此研究為安全、高效、無副作用的新型功能性產(chǎn)品的開發(fā)與研制提供了理論參考。