付興燁，李晴，呂品，2，姜雪鷗，孟迪，張夫坤

1.長春祈健生物制品有限責(zé)任公司，吉林 長春 130000；2.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）主要通過飛沫和皰疹破損液接觸進(jìn)行傳播，皮膚和黏膜組織是主要靶器官。在原發(fā)感染后，部分VZV會長期潛伏于人體脊髓后跟神經(jīng)節(jié)或顱神經(jīng)的感覺神經(jīng)節(jié)中，外傷、發(fā)熱及免疫力低下均可能激發(fā)潛伏的VZV，引起帶狀皰疹，且VZV 具有高度傳染性，隱蔽性較強(qiáng)［1-5］。VZV 基因組的遺傳穩(wěn)定性較高，但在迭代更替的過程中，表現(xiàn)出了明顯的地域特征，不同國家地區(qū)毒株間的堿基存在一定差異，這種差異主要表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）［4］。不同基因型病毒的交叉感染可能導(dǎo)致病毒基因重組，形成新的基因型，因此，VZV 的基因分型對流行病學(xué)調(diào)查和水痘疫苗的安全性監(jiān)測均具有重要意義［6-7］。

冬季是水痘和帶狀皰疹的高發(fā)季節(jié)，為更全面了解長春市冬季VZV 流行特征，本研究通過采集2020 — 2021 年冬季長春市水痘／ 帶狀皰疹患者的皰疹液樣本，提取VZV 基因，檢測其中VZV 的ORF22-SnP 位點(diǎn)堿基，以確定病毒的基因型；分析ORF38-PstⅠ、ORF54-BglⅠ、ORF62-SmaⅠ酶切位點(diǎn)，以確定流行病原是VZV 野毒株還是疫苗株?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 毒株 VZV 疫苗株（VZV-Oka，簡稱Oka 株）由長春祈健生物制品有限公司保存并提供。

1.2 樣本 選擇48 例2020 — 2021 年吉林省長春市中日聯(lián)誼醫(yī)院臨床診斷為水痘或帶狀皰疹的患者為研究對象，無菌棉簽蘸取患者的皰疹液，保存于病毒保存液中，于-78 ℃干冰保溫箱運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 病毒DNA 提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa 公司。

1.4 PCR 擴(kuò)增 參考文獻(xiàn)［8］設(shè)計PCR 引物，引物序列見表1，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。病毒DNA 提取試劑盒提取皰疹液樣本中的VZV DNA，以其為模板，采用Premix Ex TaqTM酶PCR 擴(kuò)增VZV 基因組ORF22、ORF38、ORF54 及ORF62 特異性片段。PCR 反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq 13 μL，Primer F ／ R 各0.75 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA 模板1 μL，共25 μL。PCR 反應(yīng)條件為：98 ℃5 min；98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃27 s，共30 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析。并將鑒定正確的PCR 產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.5 ORF22 的SNP 位點(diǎn)分析 應(yīng)用DNAMAN 軟件將測序結(jié)果與各基因型代表株ORF22 的5 個SNP位點(diǎn)及2 個非SNP 位點(diǎn)進(jìn)行比對分析。VZV 不同代表株ORF22 的SNP 位點(diǎn)堿基見表2，2 個非SNP 位點(diǎn)分別為37 990 和38 059，相應(yīng)堿基均為A 和C。當(dāng)標(biāo)本基因序列與某基因型代表株的SNP 位點(diǎn)堿基完全一致時，判為同一基因型。

表2 VZV 不同代表株ORF22 的SNP 位點(diǎn)堿基T ab.2 Bases of SNP sites of ORF22 various re presentative strains of VZV

1.6 酶切位點(diǎn)分析 應(yīng)用SnapGene 軟件尋找測序結(jié)果中ORF38-PstⅠ、ORF54-BglⅠ和ORF62-SmaⅠ酶切位點(diǎn)，并與Oka 株（PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ）進(jìn)行比對，以確認(rèn)是VZV 野毒株還是疫苗株。

2 結(jié) 果

2.1 ORF22 的SNP 及非SNP 位點(diǎn)分析 48 份臨床皰疹液DNA 樣本與pOka 株的SNP 位點(diǎn)完全一致，為Clade2 基因型。6 份臨床皰疹液DNA 樣本在非SNP 位點(diǎn)與pOka 株存在差異，4 和47 號樣本的37 990 位點(diǎn)由G 替代A，7、18、21、25 號樣本的38 059 位點(diǎn)由A 代替C。

2.2 酶切位點(diǎn)分析 48 份臨床皰疹液DNA 樣本中，有47 份在ORF38（69 349 位）存在PstⅠ酶切位點(diǎn)，記為PstⅠ+，1 份不存在，記為PstⅠ-；48 份于ORF54（95 241 位）存在BglⅠ酶切位點(diǎn)，記為BglⅠ+；48 份于ORF62（106 262 位）不存在SmaⅠ酶切位點(diǎn)，記為SmaⅠ-。因此，47 份臨床皰疹液DNA 樣本為PstⅠ+BglⅠ+SmaⅠ-，1 份為PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ，均與Oka 株的酶切位點(diǎn)（PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ）不一致，為VZV 野毒株。見圖1。

圖1 長春市VZV 株ORF38（A）、ORF54（B）、ORF62（C）基因不同酶切位點(diǎn)顯示Fig.1 Restriction sites of ORF38（A）、ORF5（B）and ORF62（C）genes of VZV strain in Changchun

3 討 論

目前，各國對VZV 基因分型的方法較多，其中美國Loparev 根據(jù)ORF22 的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行VZV 基因分型的方法成為各實(shí)驗(yàn)室VZV 基因主要的分型方式。為防止實(shí)驗(yàn)室間因VZV 分型方法的不同而無法進(jìn)行數(shù)據(jù)交流與分享，在2008 年英國倫敦舉行的VZV 命名會議上，確定了識別VZV 各個進(jìn)化枝的標(biāo)準(zhǔn)，即基于SNP 的基因分型方案，目前，國際研究小組已確定了Clade1 ～Clade5 5 種VZV 進(jìn)化枝和Ⅵ、Ⅶ2 種假定分支［9-10］。其中，Clade1 型以Dumas 毒株為代表，主要分布在俄羅斯及部分溫帶國家或地區(qū)；Clade2 型以pOka、Oka 毒株為代表，主要分布在日本、中國、朝鮮半島、蒙古等亞洲國家；Clade3 型以HJ0、03-500 毒株為代表，主要分布在歐洲地區(qū)；Clade4和Clade5 型主要分布在以非洲和赤道附近的熱帶、亞熱帶地區(qū)［11］。

本研究通過對臨床皰疹液樣本與基因型代表株的ORF22-SNP 位點(diǎn)進(jìn)行基因序列比對及基因分型，結(jié)果顯示，長春市48 份臨床皰疹液樣本的SNP位點(diǎn)與pOka 株一致，均屬于Clade2 基因型，并未發(fā)現(xiàn)其他基因型的毒株在長春市范圍傳播，表明該流行株的VZV 基因序列具有高度保守性。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，有6 份樣本在非SNP 位點(diǎn)上存在變異，其中2 份于37 990 位點(diǎn)由G 替代了A，4 份于38 059 位點(diǎn)由A 替代了C，多個地區(qū)的VZV 流行病學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)了這兩個位點(diǎn)的突變［12］，表明該突變在我國境內(nèi)并非偶然現(xiàn)象。長春市VZV 的流行毒株具有保守性的同時，也具有一定的多態(tài)性。

水痘減毒活疫苗在水痘疫情防控過程中起到了至關(guān)重要的作用，對流行毒株進(jìn)行疫苗株和野毒株的區(qū)分可以更直觀地了解疫苗的有效性、反應(yīng)性及安全性［13］。本研究結(jié)果表明，48 份臨床皰疹液樣本中，有47 份為PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ，1 份為PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ，與Oka 株P(guān)stⅠ-BglⅠ+SmaⅠ比較后發(fā)現(xiàn)，均為野毒株感染。所有樣本中均存在ORF54-BglⅠ酶切位點(diǎn)，這與歐美的情況有所不同，據(jù)美國和英國的調(diào)查結(jié)果顯示，只有19% ～20%臨床株存在BglⅠ酶切位點(diǎn)，表明亞洲毒株與歐美毒株存在明顯差異。疫苗接種是防控水痘的主要途徑［14-18］，在提升疫苗接種率的同時，也應(yīng)繼續(xù)做好對VZV 流行株的監(jiān)測工作，及時掌握本地區(qū)VZV 的傳播動態(tài)，為VZV 的防控提供參考。