張雷，朱衛(wèi)，黃豫，蔣潔君

昆山市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 昆山 215300

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19，簡(jiǎn)稱(chēng)新冠肺炎)是一種急性呼吸道傳染病，而中藥在改善發(fā)熱、咳嗽，避免或緩解炎癥風(fēng)暴，促進(jìn)肺部炎癥吸收、減輕并發(fā)癥等方面獨(dú)具療效[1-2]，而Akt1則是治療和預(yù)防COVID-19導(dǎo)致的肺組織損傷、消除病毒感染的潛在靶標(biāo)[3]。因此，從藥味組方角度闡明中藥配伍規(guī)律的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵，可以為充分發(fā)揮方劑藥效提供思路[4]。

達(dá)原飲始載于《溫疫論》，作為治療“濕濁”的抗疫古方，有開(kāi)達(dá)膜原，辟穢化濁，清熱解毒之功，可使穢濁得化，熱毒得清，陰津得復(fù)，為治療新冠肺炎的代表性方劑[5]，能改善患者的臨床癥狀和體征，縮短病程[6]。目前，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究預(yù)測(cè)了達(dá)原飲治療新冠肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和機(jī)制特點(diǎn)，有效成分檢測(cè)方法也得以建立[7-9]，但要進(jìn)一步探究其深層次的方劑配伍內(nèi)涵與確切作用機(jī)制，有必要結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法[10]。

本研究建立藥物、蛋白質(zhì)和通路之間的聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)，分析達(dá)原飲破結(jié)逐邪組(檳榔、厚樸、草果)、清熱滋陰組(知母、白芍、黃芩)和甘草組(甘草)等不同組分的靶標(biāo)和通路之間的關(guān)系。通過(guò)構(gòu)建大鼠急性肺炎模型[11]，以脾臟中白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α含量以及PI3K、Akt蛋白及其磷酸化表達(dá)水平為指標(biāo)，探討達(dá)原飲方劑配伍對(duì)藥效的影響，進(jìn)一步揭示達(dá)原飲治療COVID-19引起的急性肺炎作用機(jī)制，闡釋其科學(xué)配伍內(nèi)涵[12]。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑達(dá)原飲由檳榔9 g，厚樸6 g，草果3 g，知母6 g，白芍6 g，黃芩6 g，甘草3 g組成，購(gòu)自昆山市中醫(yī)院，煎煮濃縮至含生藥量濃度為1 g·mL-1，放涼，置于4 ℃冰箱備用。脂多糖(批號(hào) L2880，sigma中國(guó)公司)；IL-2 、TNF-α ELISA試劑盒(批號(hào)20210302112、20210307245，上海信帆生物公司)；PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白抗體分別由Bioss、Gene Tex、CST中國(guó)公司提供。RIPA 裂解液(批號(hào) P1010，北京索來(lái)寶公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)SH30809.01B，美國(guó)Hyclone公司)。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 目標(biāo)化合物的選取以達(dá)原飲中7味藥材的各結(jié)構(gòu)類(lèi)型代表性成分為主，結(jié)合Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中收錄的7味藥材的化學(xué)成分，共選取25個(gè)化合物為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，其中包括檳榔中4個(gè)成分(檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿)；厚樸中3個(gè)成分(厚樸酚、和厚樸酚、β-桉葉醇)；草果中3個(gè)成分(1，8-桉油素、檸檬醛、香葉醇)；知母中4個(gè)成分(知母皂苷、芒果苷、異芒果苷、淫羊藿苷)；白芍中3個(gè)成分(芍藥苷、白芍苷、沒(méi)食子酸)；黃芩中3個(gè)成分(黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素)；甘草中5個(gè)成分(甘草苷、異甘草素、甘草酸、甘草酸二銨、甘草次酸)。

1.2.2 目標(biāo)化合物作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過(guò)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得化合物的3D結(jié)構(gòu)后利用反向分子對(duì)接數(shù)據(jù)庫(kù) PharmMapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)和Swisstargets數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得分最高的前10個(gè)靶點(diǎn)篩選出來(lái)，導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//string-db.org/)，得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction,PPI)，以此分析各拆方組化合物的藥理作用異同點(diǎn)。

1.2.3 作用通路的預(yù)測(cè)與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將篩選后的靶點(diǎn)投入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到所有靶點(diǎn)蛋白的官方命名，進(jìn)行靶點(diǎn)通路富集；結(jié)合文獻(xiàn)查閱等手段，將相關(guān)化合物、靶點(diǎn)和通路導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，利用Adobe Illustrator CS5繪制達(dá)原飲化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)藥理圖，探究達(dá)原飲治療急性肺炎的多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同治療特點(diǎn)，闡釋其配伍合理性。

1.3 動(dòng)物驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.3.1 動(dòng)物模型構(gòu)建與給藥選用雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(200±10) g，購(gòu)自卡文斯百格(蘇州)模式動(dòng)物研究有限公司，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0002。將36只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組和全方組，每組6只。除空白組外，其余5組大鼠分別腹腔注射 5 mg·kg-1脂多糖(1 g·L-1)溶液建立急性肺炎模型，空白組和模型組按10 mL·kg-1灌胃生理鹽水，其余4組分別灌胃給藥達(dá)原飲提取液2 mL，連續(xù)3 d。所有大鼠造模前禁食12 h，自由飲水。

1.3.2 細(xì)胞懸液的培養(yǎng)于末次給藥2 h后，將各組大鼠脫頸處死后浸泡在體積分?jǐn)?shù)75%酒精中，超凈臺(tái)下，平衡達(dá)到室溫，刻度吸管吸取大鼠淋巴細(xì)胞分離液，加入在培養(yǎng)皿中，將無(wú)菌尼龍網(wǎng)放置于培養(yǎng)皿上，無(wú)菌取出大鼠脾臟，放置于尼龍網(wǎng)上，研磨脾臟，使脾淋巴細(xì)胞經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾后浸入淋巴細(xì)胞分離液中。隨后將培養(yǎng)皿內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至離心管中，加入RPMI-1640培養(yǎng)液形成界面，離心后可見(jiàn)上層為RPMI-1640培養(yǎng)液，中層為絮狀分布的淋巴細(xì)胞，下層為紅細(xì)胞沉淀，吸取淋巴細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)離心管中，并加入RPMI-1640培養(yǎng)液，吹打均勻，離心后可見(jiàn)白色沉淀即為淋巴細(xì)胞，棄上清液，加入RPMI-1640培養(yǎng)液吹勻重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測(cè)IL-2、TNF-α含量取培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，分別標(biāo)記收集于離心管中，待胰蛋白酶消化細(xì)胞后收集沉淀，離心后收集上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀上選擇450 nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，并根據(jù)試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算IL-2和 TNF-α 質(zhì)量濃度。

1.3.4 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測(cè)PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)取培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度，取適量加入RIPA裂解液，離心后取上清液，蛋白質(zhì)定量后存于-80 ℃冰箱備用。BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取適量的蛋白質(zhì)樣品在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，并使用半干式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至NC膜上。轉(zhuǎn)移后，膜用TBST沖洗3次，后經(jīng)PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt 一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。全蛋白以GAPDH為內(nèi)參照。次日，用熒光標(biāo)記的山羊抗兔HRP(11 000 Licor)室溫避光孵育1 h，再TBST 沖洗3次，后加ECL顯色劑入暗室進(jìn)行曝光、掃描，以Image J 統(tǒng)計(jì)條帶灰度值[13]。

2 結(jié)果

2.1 破結(jié)逐邪組作用特點(diǎn)通過(guò)篩選得到該組10個(gè)代表性化合物的49個(gè)作用靶點(diǎn)，其中草果有3個(gè)化合物，26個(gè)作用靶點(diǎn)；厚樸3個(gè)化合物，17個(gè)作用靶點(diǎn)；檳榔4個(gè)化合物，31個(gè)作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.6.0軟件得到化合物-靶點(diǎn)作用關(guān)系圖，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶點(diǎn)蛋白的PPI圖，整合得到該組藥理作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。

圖1 破結(jié)逐邪組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)功能分析，49個(gè)靶點(diǎn)蛋白主要與神經(jīng)活動(dòng)配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、膽堿能突觸、PI3K-Akt信號(hào)通路、代謝途徑和5-羥色胺能突觸等過(guò)程相關(guān)。

2.2 清熱滋陰組作用特點(diǎn)通過(guò)篩選，得到了該組10個(gè)化合物的44個(gè)作用靶點(diǎn)，其中，知母有4個(gè)化合物，18個(gè)作用靶點(diǎn)；黃芩有3個(gè)化合物，28個(gè)作用靶點(diǎn)；白芍有3個(gè)化合物，12個(gè)作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.6.0軟件得到化合物-靶點(diǎn)作用關(guān)系圖，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析了靶點(diǎn)蛋白的PPI 圖，整合得到該組藥理作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖2。

圖2 清熱滋陰組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)功能分析，44個(gè)靶點(diǎn)蛋白主要與PI3K-Akt信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、代謝途徑和cGMP-PKG信號(hào)通路等過(guò)程相關(guān)。

2.3 甘草組作用特點(diǎn)通過(guò)篩選，得到了甘草中有5個(gè)化合物，32個(gè)作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.6.0 軟件，得到化合物-靶點(diǎn)作用關(guān)系圖，通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析了靶點(diǎn)蛋白的PPI圖，整合得到甘草組藥理作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

圖3 甘草組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

通過(guò)功能分析，32個(gè)靶點(diǎn)蛋白主要與代謝途徑、內(nèi)分泌抵抗、松弛素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等生理過(guò)程相關(guān)。

2.4 達(dá)原飲配伍規(guī)律通過(guò)將達(dá)原飲的破結(jié)逐邪組、 清熱滋陰組和甘草組所有代表性化合物的作用靶點(diǎn)、作用通路整合，獲得147條有關(guān)作用特點(diǎn)的通路。將前30條通路(FDR<1×10-5)及其156個(gè)靶點(diǎn)，見(jiàn)表1、表2。利用Cystoscap 3.6.0軟件得到化合物-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4。分析發(fā)現(xiàn)，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組和甘草組既有共同的作用靶點(diǎn)群及通路群，又各有偏重，作用靶點(diǎn)涉及代謝途徑、PI3K-Akt信號(hào)通路、膽堿能突觸、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等各個(gè)環(huán)節(jié)，各通路群間通過(guò)共有靶點(diǎn)連接，顯示出不同成分間的多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用[4]。針對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模x擇細(xì)胞因子 IL-2、TNF-α的表達(dá)以及PI3K-Akt通路進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 達(dá)原飲涉及的前30條通路信息

表2 達(dá)原飲涉及的156個(gè)靶點(diǎn)信息

注：藍(lán)色菱形為活性成分，綠色橢圓為靶點(diǎn)，紫色箭頭代表前30條通路

2.5 達(dá)原飲對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2、TNF-α含量的影響與空白組比較，模型組大鼠IL-2、TNF-α含量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明造模成功；與模型組比較，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組和全方組大鼠IL-2含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組IL-2、TNF-α水平與全方組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 達(dá)原飲對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2、TNF-α含量的影響

2.6 達(dá)原飲對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響與空白組比較，模型組大鼠PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，全方組、清熱滋陰組和破結(jié)逐邪組大鼠p-PI3K、p-Akt 的表達(dá)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，甘草組僅顯著降低p-Akt含量，清熱滋陰組顯著降低PI3K蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。全方組PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)與各拆方組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4、圖5。

表4 達(dá)原飲對(duì)大鼠脾淋巴細(xì)胞PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達(dá)的影響

注：1為空白組；2為模型組；3為破結(jié)逐邪組；4為清熱滋陰組；5為甘草組：6為全方組

3 討論

冠狀病毒的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療助推了該病潛在機(jī)制的揭示，但為冠狀病毒感染患者提供安全有效的藥物方案仍在不斷優(yōu)化中。中醫(yī)方劑達(dá)原飲是治療疫病的公認(rèn)有效藥物，但其抗新冠病毒引起的急性肺炎的配伍內(nèi)涵及潛在機(jī)制尚不清楚。本研究中，先通過(guò)拆方分析，構(gòu)建了相關(guān)的藥物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)了其交叉協(xié)同的作用特點(diǎn)，再通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了可能的機(jī)制，從藥效學(xué)角度揭示了達(dá)原飲治療COVID-19引起的急性肺炎配伍科學(xué)內(nèi)涵。

已有研究發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒感染在宿主細(xì)胞中通過(guò)激活PI3K-Akt通路或提高蛋白激酶磷酸化水平進(jìn)而激活ERK-MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而完成病毒的復(fù)制和組裝，通過(guò)激活細(xì)胞因子和化學(xué)趨化因子導(dǎo)致免疫過(guò)度應(yīng)答而引發(fā)機(jī)體炎癥和細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是主要致病機(jī)制[13]，在感染后可能通過(guò)降低自身活性以躲避宿主的免疫防御[14]。但中藥可能通過(guò)降低炎性反應(yīng)、調(diào)控PI3K-Akt通路干擾病毒入侵宿主及進(jìn)行復(fù)制的過(guò)程，降低表達(dá)的同時(shí)進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制，從而發(fā)揮治療呼吸道病毒感染的作用[15]。IL-2發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，既促進(jìn)T細(xì)胞的增殖與分化，又限制其反應(yīng)以增強(qiáng)機(jī)體免疫耐受，TNF-α是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，能誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子如IL-6、IL-1β 等的釋放，共同對(duì)組織造成損傷，又可以抑制病毒介導(dǎo)的細(xì)胞病變并降低病毒數(shù)量[16-17]；脾臟是免疫細(xì)胞居住、增殖并進(jìn)行免疫應(yīng)答和產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)的基地，內(nèi)毒素(脂多糖)可以觸發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)與細(xì)胞損害，而脾切除后，脂多糖大鼠肺組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損害明顯加重[18]，間接證實(shí)脾臟在炎癥調(diào)控過(guò)程中的重要作用。故通過(guò)分析脾淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能，可以對(duì)急性肺炎在內(nèi)的相關(guān)肺損傷的臨床治療提供新思路。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，達(dá)原飲中的25個(gè)化合物與156個(gè)(前30條通路)潛在的藥物靶點(diǎn)相匹配，其藥物可作用于PI3K-Akt信號(hào)通路的IL-2和MAPK信號(hào)通路的TNF等靶點(diǎn)發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[16]。故本研究以炎癥因子IL-2、TNF和PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達(dá)水平為目標(biāo)，以此探究達(dá)原飲配伍規(guī)律和作用機(jī)制是可行的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組較空白組大鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-2、TNF含量及PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)均顯著升高；治療后，除清熱滋陰組外，達(dá)原飲其余各組IL-2、TNF水平均明顯降低；但在降低PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt表達(dá)上，除全方組外，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組作用均不全面，不能有效降低Akt 表達(dá)，只能顯著降低p-Akt表達(dá)，表明在LPS誘導(dǎo)急性肺炎后，抑制Akt的磷酸化確實(shí)是達(dá)原飲發(fā)揮作用的機(jī)制，從而證實(shí)了預(yù)測(cè)的結(jié)果。從作用效果角度看，在降低IL-2、PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)上，破結(jié)逐邪組、清熱滋陰組、甘草組效果均不及全方組(P<0.05)，這也說(shuō)明達(dá)原飲中各藥味通過(guò)協(xié)同配合，從炎癥因子IL-2、TNF和PI3K、Akt及其磷酸化蛋白表達(dá)方面起到治療COVID-19的作用。

綜上，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步闡述了達(dá)原飲各組藥材間協(xié)同配伍特點(diǎn)，并從PI3K-Akt信號(hào)通路關(guān)鍵基因及其磷酸化蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的機(jī)制，揭示了達(dá)原飲治療COVID-19引起的急性肺炎的科學(xué)內(nèi)涵，并通過(guò)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)一步展示了該藥可能的作用靶標(biāo)及途徑。但這項(xiàng)研究有一定的局限性，只是針對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的一般性質(zhì)，選取了部分靶點(diǎn)和通路進(jìn)行了分析，需要更全面的研究[12]。