侯圣凡 劉峻杰 李小峰 王紅清
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,北京 100193)
草莓(Fragaria×ananassaDuch)種植周期短、結(jié)果早且經(jīng)濟(jì)效益高,是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。我國草莓主要采用設(shè)施栽培,多年的連續(xù)種植導(dǎo)致草莓根莖部病害頻繁發(fā)生,其中以真菌病害對草莓的影響最為顯著,嚴(yán)重制約了我國草莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。
尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起的枯萎病是一種毀滅性的土傳真菌病害,致病能力強(qiáng),感染面積廣,被列為世界十大植物病原菌之一[2]。該菌有不同的?;?,分別能導(dǎo)致番茄、甜瓜、三七、辣椒、香蕉、西瓜、馬鈴薯和苜蓿等枯萎病發(fā)生,且分布廣泛,在全國各個(gè)種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生[3-6]。草莓枯萎病是由F.oxysporumf. sp.fragariae(Fof)引起的,F(xiàn)of能夠從根部快速侵染草莓,造成維管束堵塞,葉片不對稱或變形,最終致使草莓植株萎蔫和死亡。草莓枯萎病傳染性極強(qiáng),幾乎無藥可施,因此對草莓枯萎病病原菌進(jìn)行早期、特異性和準(zhǔn)確的鑒定是有效控制病害的關(guān)鍵[7]。
環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是一種新型、快捷方便、靈敏度極高且廉價(jià)的核酸擴(kuò)增方法。LAMP法有2個(gè)關(guān)鍵技術(shù)[8]:首先是引物的設(shè)計(jì),針對特異性靶序列的高度保守區(qū)域,設(shè)計(jì)4條引物以及2條環(huán)狀引物;其次是選用了Bst DNA聚合酶,該酶具有重要的鏈置換活性,能使LAMP擴(kuò)增過程中發(fā)生鏈置換反應(yīng)[9]。目前LAMP已被應(yīng)用于植物病毒、類病毒、真菌、細(xì)菌和線蟲等方面的檢測[10-12]。近年來建立了許多新的方法用于Fof的檢測,Suga等[13]利用Han-Skippy 2個(gè)轉(zhuǎn)座元件之間的基因組區(qū)域設(shè)計(jì)了引物ForfaF和ForfaR,通過普通PCR的方法實(shí)現(xiàn)了對Fof特異性擴(kuò)增;Hong等[14]以Han-Skippy基因區(qū)域?yàn)榛A(chǔ),利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對Fof進(jìn)行檢測;Burkhardt等[15]利用Han-Skippy區(qū)域設(shè)計(jì)重組酶聚合酶反應(yīng)引物與Taqman熒光檢測相結(jié)合也實(shí)現(xiàn)了對Fof的鑒定,以上檢測手段都需要昂貴的檢測設(shè)備且檢測時(shí)間過長。針對草莓枯萎病的LAMP檢測技術(shù)國內(nèi)還未見報(bào)道。因此,本研究以Fof特異性區(qū)域Han-Skippy為靶序列,利用SYBR Green I染料建立Fof的LAMP檢測技術(shù),并通過組織培養(yǎng)法和PCR法加以輔佐驗(yàn)證,以期實(shí)現(xiàn)草莓枯萎病的快速檢測。
本研究共選用16種北京地區(qū)草莓的重要病原菌或常見的土傳病原菌,其中F.oxysporumf. sp.fragariae3株,其他種類病原菌各1株(表1)。將上述菌株用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板在25 ℃下培養(yǎng)5 d后收集菌絲,使用BufferA和BufferB法提取DNA[1],置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 試驗(yàn)用病原菌株Table 1 Pathogen strains in this test
以Fof轉(zhuǎn)座子Han-Skippy[13]基因序列為靶序列,用LAMP在線設(shè)計(jì)軟件(http:∥primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html)選定了3套引物,但只有1套引物帶有Loop引物,故選擇此套引物作為最優(yōu)的LAMP引物(表2),各引物在靶序列的相對位置見圖1。
F3和B3為外引物;F2和F1為FIP內(nèi)引物;B1和B2為BIP內(nèi)引物;LF為環(huán)引物。F3 and B3 are external primers; F2 and F1 are internal primers FIP; B1 and B2 are internal primers of BIP; LF is loop primer.圖1 Fof-LAMP引物在Han-Skippy序列上的定位Fig.1 The location of Fof-LAMP primers on the aligned Han-Skippy sequence
表2 LAMP和PCR引物序列Table 2 LAMP and PCR primers used in this study
以Fof轉(zhuǎn)座子Han-Skippy基因區(qū)域?yàn)槟0暹M(jìn)行LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化,參考杜然等[16]的方法并加以改進(jìn)。具體如下:以Bst DNA聚合酶(Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase)為基礎(chǔ)配制,具體成分包括:2.50 μL 10×Thermo Pol Buffer、0.25 μL Mg2+溶液(100 mmol/L)、1.00 μL dNTPs溶液(10 mmol/L)、1.00 μL FIP溶液(20 μmol/L)、1.00 μL BIP溶液(20 μmol/L)、0.50 μL F3(10 μmol/L)、0.50 μL B3(10 μmol/L)、0.75 μL LoopF溶液(10 μmol/L)、0.50 μL Bst DNA聚合酶溶液(8 U/μL)、1.00 μL Betaine(5 mol/L)、1.00 μL模板DNA溶液(450 ng/μL),補(bǔ)足ddH2O至25.00 μL。將LAMP反應(yīng)體系置于62.9 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min,然后向該體系中加入0.40 μL的10 000×SYBR Green I染料,在紫外燈下觀察反應(yīng)液顏色。熒光綠色為陽性,褐色為陰性。使用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳對反應(yīng)液進(jìn)行檢測,有梯形條帶為陽性,無條帶為陰性。
對LAMP反應(yīng)因子Bst DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和各條引物的濃度分別進(jìn)行條件優(yōu)化。設(shè)置Bst DNA 聚合酶濃度梯度為0.08、0.16、0.24和0.32 U/μL,設(shè)置Mg2+濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mmol/L,設(shè)置dNTPs濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mmol/L。在最適Bst DNA聚合酶濃度(0.16 U/μL)、Mg2+濃度(1.0 mmol/L)和dNTPs濃度(0.4 mmol/L) 的條件下,設(shè)置內(nèi)引物(FIP和BIP)濃度梯度為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μmol/L、外引物(F3和B3)濃度梯度為0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L和正向環(huán)引物(Loop F)濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L。設(shè)置Betaine濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L。在各反應(yīng)因子最佳的濃度條件下,優(yōu)化LAMP反應(yīng)溫度,在50.0~68.5 ℃范圍中,逐步鎖定最優(yōu)反應(yīng)溫度范圍。然后對LAMP反應(yīng)時(shí)間梯度進(jìn)行優(yōu)化。每步驟重復(fù)3次。
提取Fof-DNA為模板,調(diào)整其濃度為450 ng/μL,然后將其以10倍梯度連續(xù)稀釋為45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL、45 pg/μL、4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL和4.5 fg/μL。每梯度取1 μL DNA作為LAMP反應(yīng)模板,陰性對照使用ddH2O,在62.9 ℃水浴鍋中反應(yīng)60 min。
同時(shí),以各濃度梯度的Fof-DNA為模板進(jìn)行常規(guī)PCR檢測。該P(yáng)CR反應(yīng)體系(25 μL)包括:12.5 μL 2×2*SWTaq酶Mix、正引物FofraF溶液(10 μmol/L)和反引物FofraR溶液(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板溶液1 μL,用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。ddH2O作為陰性對照。PCR反應(yīng)程序:94 ℃ 預(yù)變形3 min;94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸3 min。反應(yīng)結(jié)束后,使用2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,擴(kuò)增的DNA條帶為239 bp。試驗(yàn)重復(fù)3次。
本研究所用的F.oxysporumf. sp.fragariae由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他用于特異性檢測的還包括層生鐮刀菌(F.proliferatum)、水稻惡苗病菌(F.fujikuroi)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)、葡萄孢菌(B.cinerea)、煙疫霉菌(P.nicotianae)、螺旋疫霉(P.helicoides)、大麗輪枝菌(V.dahliae)、擬盤多毛孢(N.clavispora)、擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)、共享鐮孢菌(F.commune)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、鏈格孢菌(A.alternata)、總狀毛霉(M.racemosus)和柱孢菌(Cylindrocladiella)共16個(gè)草莓普遍存在的病原菌和常見土傳病原菌菌株。以ddH2O代替真菌DNA作為陰性對照。試驗(yàn)重復(fù)3次。
從北京通州草莓大棚中隨即采集16株葉片枯萎、根部腐爛、維管束褐變,疑似草莓枯萎病癥狀的植株,以及1株健康草莓植株用于LAMP檢測。用刀片將發(fā)病以及健康的試驗(yàn)樣品根莖部維管束病健交接處切下,各取0.15 g放入液氮中研成粉末,用TIANGEN-DNAsecure Plant Kit提取其中的DNA,置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩7謩e以各草莓根莖樣品的DNA和Fof的DNA為模板,按LAMP體系進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在紫外燈下觀察反應(yīng)管顏色變化并且進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時(shí),利用Fof特異性引物FofraF和FofraR對田間樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測,進(jìn)一步佐證LAMP試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次。
根據(jù)Fof轉(zhuǎn)座子Han-Skippy基因區(qū)域?yàn)槟0逶O(shè)計(jì)了5條LAMP引物。LAMP引物包括2條內(nèi)引物FIP和BIP、2條外引物F3和B3、1條環(huán)引物L(fēng)oopF。通過對Fof反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定Fof-LAMP(25 μL)各反應(yīng)因子的最佳終濃度為:Bst DNA聚合酶0.16 U/μL、Mg2+1 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、FIP和BIP各0.8 μmol/L、F3和B3各0.2 μmol/L、LoopF 0.3 μmol/L、Betaine 0.2 mol/L和0.4 μL SYBR Green I染料(表3)。
表3 檢測Fof的LAMP體系Table 3 The LAMP system to detect Fof
對Fof-LAMP反應(yīng)溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,當(dāng)溫度為57.5~65.9 ℃時(shí),F(xiàn)of-LAMP才會發(fā)生反應(yīng)(圖2(a))。當(dāng)溫度在58.0~65.4 ℃時(shí),各溫度下反應(yīng)液發(fā)出的熒光綠色亮度基本無異,但62.9 ℃下,反應(yīng)液的瓊脂糖凝膠電泳條帶更亮(圖2(b)),說明Fof-LAMP反應(yīng)效率更高,所以選擇62.9 ℃作為Fof-LAMP的最適溫度。
(a) M為分子量標(biāo)記;1~7表示反應(yīng)溫度分別為50.0、51.4、53.8、57.5、62.0、65.9和68.5 ℃,8為陰性對照;(b)M為分子量標(biāo)記;1~7表示反應(yīng)溫度分別為 58.0、58.6、59.6、61.1、62.9、64.4和65.4 ℃,8為陰性對照。圖片上半部分為 LAMP 檢測,下半部分為各樣品相對應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖2、3和4同。(a) M is marker; 1 to 7 indicate that reaction temperatures are 50.0, 51.4, 53.8, 57.5, 62.0, 65.9 and 68.5 ℃, respectively, 8 is negative control; (b) M is marker; 1 to 7 indicate that Reaction temperatures are 58.0, 58.6, 59.6, 61.1, 62.9, 64.4 and 65.4 ℃, respectively, 8 is negative control.The upper part of the figure is LAMP detection; The lower part of the figure shows agarose gel electrophoresis detection corresponding to each sample.Fig 2, 3 and 4 are the same.圖2 Fof的LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化Fig.2 The temperature optimization of Fof LAMP reaction
在最適溫度條件下對Fof-LAMP的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化(圖3)。結(jié)果表明,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在45 min以上時(shí),F(xiàn)of-LAMP就會發(fā)生反應(yīng)且各時(shí)間段間熒光綠色亮度無異。將各時(shí)間段的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,可以看出當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在60 min以上時(shí),各時(shí)間段間電泳條帶亮度無異。說明當(dāng)LAMP反應(yīng)時(shí)間在60 min時(shí),F(xiàn)of-LAMP已反應(yīng)充分,所以Fof-LAMP的最適反應(yīng)時(shí)間為60 min。
M為分子量標(biāo)記;1~7表示反應(yīng)時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90和105 min,8為陰性對照。M is marker; 1 to 7 indicate that reaction time are 15, 30, 45,60, 75, 90 and 105 min, respectively, 8 is negative control.圖3 Fof的LAMP反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化Fig.3 The LAMP reaction time optimization of Fof
使用LAMP引物對草莓上常見的病原菌進(jìn)行LAMP特異性檢測。結(jié)果表明,含有Fof的3個(gè)樣品(1號)反應(yīng)后在紫外燈下發(fā)出熒光綠色,且在瓊脂糖凝膠電泳中有3條明亮的梯形條帶(圖4)。而2~16號中非目的病原菌反應(yīng)后在紫外燈下未發(fā)出熒光綠色,且瓊脂糖凝膠電泳無梯形條帶,與17號陰性對照結(jié)果一致。故本研究設(shè)計(jì)的LAMP引物針對Fof具有良好的特異性。
M為分子量標(biāo)記;1~16見表1各菌序號, 17為陰性對照。M is marker; 1 to 16 are Table 1 sequence number of pathogenic strains, 17 is negative control.圖4 Fof的LAMP特異性檢測Fig.4 Specificity test of Fof by LAMP assay
以10倍梯度稀釋的Fof-DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,結(jié)果顯示當(dāng)DNA濃度為450 ng/μL、45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL和45 pg/μL時(shí)LAMP反應(yīng)呈SYBR Green I綠色,瓊脂糖凝膠電泳顯示有梯形條帶產(chǎn)生(圖5(a)),而DNA的濃度為4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL和4.5 fg/μL時(shí)LAMP反應(yīng)呈褐色的陰性反應(yīng),說明該反應(yīng)體系最低可檢測到的模板DNA濃度為45 pg/μL。而常規(guī)PCR擴(kuò)增中,最低可檢測到的模板DNA濃度也為45 pg/μL(圖5(b))。因此,LAMP檢測的靈敏度與常規(guī)PCR一致。
M為分子量標(biāo)記;1~9表示DNA濃度分別為450 ng/μL、45 ng/μL、4.5 ng/μL、450 pg/μL、45 pg/μL、4.5 pg/μL、450 fg/μL、45 fg/μL和4.5 fg/μL,10為陰性對照。(a)上半部分為LAMP檢測;下半部分為各樣品相對應(yīng)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。(b)常規(guī)PCR檢測。下同。M is marker; 1 to 9 indicated that the DNA concentrations are 450 ng/μL, 45 ng/μL, 4.5 ng/μL, 450 pg/μL, 45 pg/μL, 4.5 pg/μL, 450 fg/μL, 45 fg/μL and 4.5 fg/μL, respectively, 10 is negative control. (a) The upper part is LAMP detection; The lower part shows agarose gel electrophoresis detection corresponding to each sample on the upper part. (b)The conventional PCR assay. The same below.圖5 Fof的LAMP靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity test of the LAMP assay for Fof
分別從16株罹病草莓根莖部維管束病健交接處采集DNA將其作為模板進(jìn)行LAMP和PCR檢測。結(jié)果表明在Fof陽性模板以及2~13號發(fā)病植株的反應(yīng)產(chǎn)物顯現(xiàn)熒光綠色,且擴(kuò)增出梯形DNA條帶(圖6(a));而陰性模板、健康草莓根莖模板以及14~17號發(fā)病植株反應(yīng)產(chǎn)物為褐色,也沒有擴(kuò)增到梯形DNA條帶。說明16株草莓感病植株中2~13號植株的病原菌是Fof, 而14~17號植株為其他病原菌。
同時(shí),常規(guī)PCR檢測結(jié)果表明LAMP反應(yīng)呈現(xiàn)熒光綠的草莓植株根模板會擴(kuò)增出一條大小為239 bp的DNA條帶,其中2、5、6、7、8和9號病株DNA提取液中沒有擴(kuò)增出條帶(圖6(b))??赡苁怯捎贒NA提取液中Fof的含量過低。
M為分子量標(biāo)記;1為陽性對照,2~17為草莓患病植株的模板DNA,18為健康植株的模板DNA,19為陰性對照。M is marker; 1 is postive control, 2-17 are template DNA from diseased stems of strawberry, 18 is template DNA from healthy stems, 19 is negative control.圖6 Fof的LAMP田間檢測Fig.6 Field susceptible plants test of the LAMP assay for Fof
由F.oxysporumf. sp.fragariae引起的草莓枯萎病是一種嚴(yán)重的土傳病害,僅通過早期癥狀難以辨認(rèn),而且癥狀一旦顯現(xiàn)后,病害將無法控制,所以對該病害早期快速的檢測顯得尤為重要。傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法是通過組織分離法培養(yǎng)病原菌,對其進(jìn)行PCR生物學(xué)鑒定,此法至少需要5~7 d完成,耗時(shí)過長[17],而LAMP法從采樣到鑒定完成僅需1 d即可。LAMP檢測技術(shù)因其獨(dú)特優(yōu)勢,已被廣泛用于檢測各種植物病害,Duan等[18]使用HNB-LAMP技術(shù)對番茄灰霉病進(jìn)行檢測;Yang等[19]使用SYBR-Green I-LAMP實(shí)現(xiàn)了對梨黑斑病的快速檢測;楊帆等[20]建立了青稞黑穗病的LAMP檢測體系;Chen等[21]也是通過LAMP技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對油橄欖炭疽病的快速檢測。
LAMP反應(yīng)過程會析出大量焦磷酸根離子,其與反應(yīng)液中的Mg2+結(jié)合,形成乳白色焦磷酸鎂沉淀。因此,可以通過觀察反應(yīng)液中是否形成白色混濁來判斷靶序列是否存在[8],也可以向LAMP反應(yīng)中添加核酸染料或金屬離子指示劑,通過反應(yīng)液顏色的變化來判斷反應(yīng)結(jié)果。如Katoh等[22]通過使用羥基萘酚藍(lán)(HNB)對Fof的LAMP反應(yīng)液進(jìn)行顯色處理,陰性反應(yīng)呈紫色,陽性反應(yīng)呈天藍(lán)色。而本研究則使用SYBR Green I熒光染料對LAMP反應(yīng)液進(jìn)行顯色處理,陰性反應(yīng)呈褐色,陽性反應(yīng)呈熒光綠色。與SYBR Green I熒光染料相比,HNB檢測靈敏度較高,但反應(yīng)前后顯色不明顯,不利于人們進(jìn)行肉眼檢測,且HNB的顯色會根據(jù)LAMP反應(yīng)中添加各試劑的來源廠家不同和添加比例不同而存在差異,所以通過HNB顯色具有很強(qiáng)的主觀性。使用SYBR Green I熒光染料對LAMP反應(yīng)進(jìn)行顯色,會更加方便客觀的實(shí)現(xiàn)對草莓枯萎病的檢測。但由于SYBR Green I熒光染料需要在LAMP反應(yīng)后添加到體系中,所以對添加染料的環(huán)境以及操作者的技術(shù)有要求,否則極易造成假陽性。
LAMP特異性檢測共檢測了16種草莓上常見的病原菌以及土傳病原菌。其中膠孢炭疽菌、煙疫霉菌和擬盤多毛孢都可造成草莓致死,作為Fof的主要對照菌,而其他菌可能會在采樣過程中污染樣品,所以作為次要的區(qū)分對照菌。本研究所建立的LAMP檢測方法可以將Fof與其他15種菌區(qū)分開,其特異性滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。本研究也曾對Fof接種的土壤樣品以及枯萎病田間土壤樣品進(jìn)行分別檢測,但并未檢測到Fof的存在。分析可能存在的原因:一是對土壤樣品中Fof的提取率太低;二是Fof本身屬于半活體營養(yǎng)型真菌,只有活體存在時(shí)才有利于Fof的增殖生存,所以土壤中病原菌很難被檢測到。在對諸多病原菌的LAMP檢測中,LAMP的檢測靈敏度往往比普通的PCR檢測高10~100倍。本研究在靈敏度檢測試驗(yàn)中,由于Fof是純模板且濃度高,普通PCR檢測時(shí)長為1.5~2.0 h,而LAMP檢測時(shí)長為1.0 h,不同方法中目的片段擴(kuò)增量可能存在差異,使得普通PCR檢測靈敏度與LAMP檢測靈敏度相似。而在實(shí)際的田間檢測中,2、5、6、7、8和9號病株只能被LAMP檢測到,可見LAMP檢測靈敏度仍是高于普通PCR。
綜上所述,本研究開發(fā)的LAMP檢測體系為草莓枯萎病綜合防治提供了一條新的途徑,未來還需要一種高靈敏度且可以提前檢測土壤中是否含有Fof的方法,實(shí)現(xiàn)對草莓枯萎病的早發(fā)現(xiàn)和早防治。