管芩瀾，龔明福

（樂山師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614004）

0 引言

青梅(Prunus mume(Sieb.) Sieb.et zucc.)，又稱為酸梅、果梅，為薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)植物，主要分布于中國(guó)、日本、韓國(guó)、朝鮮、泰國(guó)等亞洲國(guó)家以及歐洲及美國(guó)等地。我國(guó)是青梅的原產(chǎn)地及世界上適合生產(chǎn)青梅地域最廣的國(guó)家，廣東、廣西、四川、浙江、江蘇、福建及臺(tái)灣等18 個(gè)省（自治區(qū)）均適合生產(chǎn)。青梅不僅營(yíng)養(yǎng)豐富[2-3]，還具有獨(dú)特的藥用價(jià)值[4-8]，中國(guó)古代藥典均有著青梅的諸多藥用記載。目前對(duì)青梅的研究主要集中于青梅種質(zhì)資源開發(fā)[9-10]、栽培技術(shù)[11]、加工產(chǎn)品[12-14]、病蟲害防治[15-17]等方面，對(duì)青梅的菌根真菌研究鮮見報(bào)道。項(xiàng)目組通過近三年對(duì)馬邊縣三河口鎮(zhèn)青梅林的觀察和了解，發(fā)現(xiàn)青梅菌只能生長(zhǎng)在青梅林下，并且青梅菌子實(shí)體僅在4 月上旬到5月上旬出現(xiàn)（土壤溫度13～18 ℃）。

青梅菌，是青梅的一種外生菌根真菌，學(xué)名為晶蓋粉褶菌（Entoloma clypeatum），隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，層菌綱(Hymenomycet)，傘菌目(Agaricales)，粉褶菌科(Entolomataceae) 粉褶菌屬（Entoloma(Fr.) P.Kumm.），能夠與薔薇科的薔薇屬、梨屬、李屬、海棠屬等植物形成外生菌根[18-20]。青梅菌作為粉褶菌屬成員之一，在食用和醫(yī)療具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[21-23]。我國(guó)對(duì)粉褶菌屬真菌的研究主要集中在分類上，對(duì)粉褶菌進(jìn)行分離培養(yǎng)和人工栽培方面的研究未見報(bào)道，國(guó)外學(xué)者從組織中和通過擔(dān)孢子分離獲得了晶蓋粉褶菌的遺傳多樣性的菌株[24-28]，并回接杜梨獲得子實(shí)體[29]。

菌根真菌是一類能夠與木本植物共生形成外生菌根的大型真菌，中國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可食用菌根真菌有677 種，占食用菌種類70%[22]。由于菌根真菌生長(zhǎng)的特殊性，一直以來沒有得到人類的重視。除松口蘑、紅菇等少數(shù)菌根菌被開發(fā)利用外，大多數(shù)都任其自生自滅，青梅菌目前仍處于這樣的狀態(tài)。

因此，栽培青梅菌的價(jià)值與意義十分重大。本研究擬通過人工分離獲得青梅菌菌絲體，研究青梅菌菌絲生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)條件和溫度需求，為青梅菌的半人工栽培和人工栽培提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

青梅菌菌絲體分離和培養(yǎng)用PDA 培養(yǎng)基。

青梅菌原種培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基配方如下：基礎(chǔ)配方為麩皮10%，石灰1%，石膏1%，供試材料為玉米粒、玉米渣、棉籽殼、木屑和麥粒，添加量均為88%。

1.2 青梅菌菌絲的分離與純化

青梅菌子實(shí)體于2020 年4 月5 日采集自四川省樂山市馬邊彝族自治縣三河口鄉(xiāng)王家覺壩村（經(jīng)度103.352°，緯度28.894°，海拔：1 228.54 m），氣溫16 ℃，土壤溫度14 ℃（見圖1、圖2）。

圖1 青梅菌子實(shí)體采集地點(diǎn)

圖2 青梅菌生長(zhǎng)環(huán)境

采集到的青梅菌子實(shí)體當(dāng)日送到實(shí)驗(yàn)室，依次用75%的乙醇和5%的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌解剖刀去除消毒后的表皮后，用無(wú)菌解剖針挑取黃豆粒大小的組織塊，接種于PDA平板上，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)3～5d[30]，取生長(zhǎng)良好、無(wú)雜菌污染的菌絲在PDA 平板上進(jìn)一步純化獲得青梅菌純培養(yǎng)[31-32]，保存于PDA 斜面?zhèn)溆谩?/p>

1.3 溫度對(duì)青梅菌母種菌絲生長(zhǎng)的影響

用無(wú)菌打孔器將培養(yǎng)在PDA 平板上青梅菌菌絲體打成圓形菌餅（直徑7 mm），用解剖針將青梅菌菌餅接種到新鮮的PDA 平板中央，分別放置在11 ℃、17 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，測(cè)定菌落直徑，計(jì)算青梅菌母種菌絲日均生長(zhǎng)速率。

1.4 溫度對(duì)青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的影響

采用棉籽殼培養(yǎng)基，按配方配好料后，分裝到100 mL 的組培瓶中，每瓶分裝2/3 體積，121 ℃40 min 滅菌，冷卻后接入青梅菌母種，分別放置在17 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算青梅菌原種日均生長(zhǎng)速率。

1.5 培養(yǎng)基對(duì)青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的影響

采用玉米粒、玉米渣、棉籽殼、木屑和麥粒為主粒的5 種培養(yǎng)基配方，配方見1.1。各配方培養(yǎng)基按配方配好料后，分裝到100 mL 的組培瓶中，每瓶分裝三分之二體積，121 ℃40 min滅菌，冷卻后接入青梅菌母種，25 ℃培養(yǎng)10 d，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算青梅菌原種日均生長(zhǎng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 青梅菌母種菌絲的分離與純化

用組織塊無(wú)菌分離法獲得青梅菌母種菌絲體（見圖3）。

圖3 青梅菌母種

2.2 溫度對(duì)青梅菌母種菌絲生長(zhǎng)的影響

青梅菌母種菌絲在不同溫度下的日均生長(zhǎng)速率見表1。由表1 可以看出，隨著溫度升高，青梅菌菌絲生長(zhǎng)在22 ℃以下逐漸加快，在22 ℃以上逐漸減慢，22 ℃是青梅菌母種菌絲生長(zhǎng)的最適溫度。

表1 溫度對(duì)青梅菌母種菌絲生長(zhǎng)的影響（菌絲日均生長(zhǎng)速率：mm/d）

圖4 青梅菌母種11℃下生長(zhǎng)狀況

2.3 溫度對(duì)青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的影響

青梅菌原種菌絲在不同溫度下的生長(zhǎng)情況見表2。由表2 可以看出，青梅菌菌絲日均生長(zhǎng)速率在25 ℃最高，在25 ℃以下隨著溫度升高逐漸加快，在25 ℃以上隨著溫度升高逐漸減慢，25 ℃是青梅菌原種菌絲的最適生長(zhǎng)溫度。

表2 溫度對(duì)青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的影響（菌絲日均生長(zhǎng)速率：mm/d）

2.4 培養(yǎng)基對(duì)青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的影響

青梅菌原種在不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況見表3。由表3 可以看出，青梅菌原種菌絲在棉籽殼培養(yǎng)基中的日均生長(zhǎng)速率極顯著的高于其他4 種培養(yǎng)基，因此棉籽殼培養(yǎng)基是青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。

表3 培養(yǎng)基對(duì)青梅菌原種菌絲生長(zhǎng)的影響（菌絲日均生長(zhǎng)速率：mm/d）

圖5 玉米粒培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的青梅菌

圖6 棉籽殼培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的青梅菌

3 結(jié)論與討論

對(duì)人工分離獲得的青梅菌菌絲最適生長(zhǎng)溫度范圍和適宜的培養(yǎng)基配方探究，研究結(jié)果表明，青梅菌母種菌絲的最適生長(zhǎng)溫度為22 ℃，原種菌絲的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最佳培養(yǎng)基配方為棉籽殼培養(yǎng)基，配方為棉籽殼88%、麩皮10%、石灰1%、石膏1%。

Shishikura M.等人在20 ℃培養(yǎng)晶蓋粉褶菌的菌絲體[28]，與本文分離的青梅菌母種菌絲最適生長(zhǎng)溫度接近，他們用晶蓋粉褶菌菌絲體接種杜梨的根后在15℃下進(jìn)行共培養(yǎng)2 個(gè)月后獲得[29]青梅菌子實(shí)體，這和我們采樣時(shí)土壤溫度接近，而與菌絲最適生長(zhǎng)溫度差別較大，可能的原因是青梅菌菌絲的最適生長(zhǎng)溫度與子實(shí)體形成最適溫度不同，或者菌絲在原位生長(zhǎng)環(huán)境中的生長(zhǎng)溫度與人工培養(yǎng)條件存在差異，也可能與菌株的特性有關(guān)，需要進(jìn)一步做和植物根的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)僅僅對(duì)青梅菌菌絲體的生長(zhǎng)溫度和適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行了探索，作為外生菌根真菌的一員，至少還需要回接到青梅的根部進(jìn)行共培養(yǎng)，探究其子實(shí)體形成的條件，在此基礎(chǔ)上才能建立起人工培養(yǎng)的技術(shù)體系，這還有很多工作要做。