張昊東 康 權(quán) （重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院渝中院區(qū)普外科，國(guó)家兒童健康與疾病臨床研究中心，兒童發(fā)育與疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市干細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心，重慶 400014）

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是一種嚴(yán)重的新生兒疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性炎癥和纖維化阻塞肝內(nèi)和肝外膽管，如不經(jīng)治療大部分患兒2 歲內(nèi)會(huì)因進(jìn)行性纖維化肝衰竭而死亡，進(jìn)行葛西手術(shù)后約一半患兒仍伴有進(jìn)行性肝纖維化，但經(jīng)過(guò)肝移植手術(shù)后大部分患兒可存活至成年［1-2］。

基于目前研究，無(wú)論是哪種因素誘發(fā)的BA，均會(huì)激活BA 先天性及適應(yīng)性免疫應(yīng)答，且均支持炎癥反應(yīng)促進(jìn)膽管損傷［3］。已有多個(gè)研究將病理組織學(xué)和臨床信息及預(yù)后聯(lián)系起來(lái)，提示兒童預(yù)后不良或與纖維化有關(guān)［4-5］。

盡管免疫細(xì)胞及免疫相關(guān)細(xì)胞因子或趨化因子、細(xì)胞因子受體在BA 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如樹(shù)突狀細(xì)胞、NK 細(xì)胞以及CD4/CD8 在診斷時(shí)位于嬰兒肝臟中，直接參與上皮破壞和促進(jìn)適應(yīng)性炎癥反應(yīng)發(fā)展，并與過(guò)度表達(dá)的活化標(biāo)志物有關(guān)［5］。體外 T 細(xì)胞研究表明，BA 患者 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞具有寡克隆擴(kuò)增功能［6］。但尚無(wú)系統(tǒng)研究分析BA 不同病理分期的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，以及免疫相關(guān)基因和分子通路表達(dá)差異。因此，本研究擬評(píng)估BA不同病理分期中的免疫相關(guān)基因，以及浸潤(rùn)免疫細(xì)胞和途徑激活水平差異。

1 材料與方法

1.1 材料 從NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）下載GSE15235 芯片數(shù)據(jù)集。GSE15235 表達(dá)數(shù)據(jù)以GPL570 相應(yīng)探針注釋。該數(shù)據(jù)集包含47 個(gè)有病理臨床信息的BA 樣本，選取其中組織學(xué)評(píng)分≥2 分的14 個(gè)主要為炎癥（n=9）和纖維化（n=5）的樣本進(jìn)行分析。從 ImmPort（https：//www. immport. org/home）數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到2 498個(gè)免疫相關(guān)基因。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及基因差異分析 采用R 軟件包limma 對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，差異基因的篩選截?cái)嘀翟O(shè)為|log2FC|＞1，P＜0.05，并與 ImmPort下載的免疫相關(guān)基因取交集得到免疫相關(guān)差異基因（趨化因子、細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體等）。

1.2.2 免疫細(xì)胞評(píng)估 采用ImmuCellAI 在線網(wǎng)站分析芯片數(shù)據(jù)，包括18 個(gè)T-細(xì)胞亞群的24 種免疫細(xì)胞豐度。

1.2.3 基因富集分析 采用clusterProfiler 軟件包進(jìn)行富集分析，富集分析基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以P＜0.05為顯著富集的臨界值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)比較不同組免疫細(xì)胞豐度。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試和可視化分析均采用R軟件（3.6.3版本）完成。

2 結(jié)果

2.1 免疫相關(guān)基因表達(dá) 通過(guò)差異分析得到91個(gè)差異基因，其中40個(gè)炎癥組上調(diào)，51個(gè)纖維組上調(diào)，并將包含于ImmPort 數(shù)據(jù)庫(kù)中的免疫相關(guān)基因用熱圖表示（圖1）。包含13 個(gè)免疫相關(guān)基因MMP9、IL1RL1、RASGRP1、MPO、CCL20、SEMA6A、CXCL11、PTX3、HSPA6、CTSG、RNASE3、GREM1 和 CD8A，表達(dá)情況見(jiàn)表1。KEGG 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路（圖2A），GO 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要參與的分子生物學(xué)過(guò)程包括抗菌體液反應(yīng)、對(duì)真菌、細(xì)胞外基質(zhì)的組織、對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞激活參與免疫應(yīng)答及嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒過(guò)程等（圖2B）。

圖2 免疫相關(guān)差異基因的KEGG和GO富集分析Fig.2 KEGG and GO enrichment analysis of immune-related differentially expressed genes

表1 免疫相關(guān)差異表達(dá)基因Tab.1 Immune-related differentially expressed genes

圖1 BA炎癥組和纖維化組差異表達(dá)基因Fig.1 Differentially expressed genes between inflammatory group and fibrotic group in BA

2.2 免疫細(xì)胞表達(dá) 通過(guò)ImmuCellAI 在線工具評(píng)估GSE15235數(shù)據(jù)集的14個(gè)包含病理分級(jí)的肝臟樣本（5 個(gè)主要表現(xiàn)為炎癥和9 個(gè)主要表現(xiàn)為纖維化）的24 種免疫細(xì)胞豐度（圖3A）。肝纖維化組中顯示nTreg 及iTreg 呈高表達(dá)，NKT 細(xì)胞及中性粒細(xì)胞呈低表達(dá)（圖3B）。

圖3 BA中24種免疫細(xì)胞豐度Fig.3 Abundance of 24 types of immune cells in BA

2.3 基因集富集分析 根據(jù)BA 不同分期組基因表達(dá)GSEA 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過(guò)KEGG 注釋的通路中炎癥組，如ErbB 信號(hào)途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用及代謝相關(guān)途徑被顯著激活。纖維化組主要激活的途徑有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、維生素A新陳代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、其他類(lèi)型O-聚糖生物合成及EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥等途徑（圖4A）。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的分子生物學(xué)過(guò)程顯示炎癥組富集的主要為白細(xì)胞聚集、白細(xì)胞遷移參與炎癥反應(yīng)及黏膜先天免疫應(yīng)答過(guò)程等，而纖維化組主要富集于T細(xì)胞受體復(fù)合物、T 細(xì)胞趨化調(diào)節(jié)、調(diào)控趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、干擾素分泌調(diào)節(jié)、賦予抗拉強(qiáng)度的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分及膠原蛋白-激活信號(hào)等過(guò)程（圖4B）。

圖4 基因集富集分析Fig.4 Gene sets enrichment analysis

3 討論

本研究旨在探討B(tài)A 肝臟不同病理分期的免疫微環(huán)境差異。通過(guò)差異分析得到13個(gè)免疫相關(guān)差異基因，MMP9、IL1RL1、MPO、CCL20、PTX3、HSPA6、CTSG和RNASE3主要在炎癥組中高表達(dá)，RASGRP1、SEMA6A、CXCL11、GREM1 和 CD8A 主要在纖維化組中高表達(dá)。KEGG 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要富集于細(xì)胞因子受體相互作用通路，GO 富集分析顯示免疫相關(guān)差異基因主要參與的分子生物學(xué)過(guò)程包括抗菌體液反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)的組織、對(duì)細(xì)菌的防御反應(yīng)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、中性粒細(xì)胞激活、中性粒細(xì)胞激活參與免疫反應(yīng)及嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒過(guò)程。Immu-CellAI 分析提示肝纖維化組中nTreg 及iTreg 呈高表達(dá)，NKT 細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在炎癥組中高表達(dá)。GSEA 分析顯示炎癥組主要激活代謝及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)類(lèi)分子途徑等，纖維化組主要激活細(xì)胞基質(zhì)及T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)分子途徑。

免疫相關(guān)細(xì)胞因子、趨化因子和受體與促炎纖維化信號(hào)的觸發(fā)和放大密切相關(guān)，如小鼠BA 模型中IL-1R1或NLRP3靶向損失，可保護(hù)新生小鼠免受RRV 誘導(dǎo)的膽管阻塞［7］；基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族廣泛參與炎癥過(guò)程，MMP9 可防止LPS 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥及可限制結(jié)腸炎相關(guān)癌癥中的活性氧積累和DNA損傷［8-9］；髓過(guò)氧化物酶是白細(xì)胞分泌的一種高度氧化酶，與人類(lèi)和實(shí)驗(yàn)性非酒精性脂肪性肝炎有關(guān)，且在機(jī)制上還與房顫和纖維化有關(guān)［10-12］；一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)隨著肝病患者肝纖維化程度增加，CXCL11 水平升高［13］；還有研究表明CXCL11 通過(guò)改變異常的血管重塑抑制肺纖維化［14］。表明免疫相關(guān)基因在炎癥期或纖維化期發(fā)揮重要作用。

BA 患兒診斷時(shí)肝臟有多種免疫細(xì)胞（CD4+細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及 DC 細(xì)胞）和促炎細(xì)胞因子（細(xì)胞因子、趨化因子和白細(xì)胞介素等）浸潤(rùn)。Treg 作為一種調(diào)劑免疫耐受的細(xì)胞，在調(diào)控免疫細(xì)胞，如CD8 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及Th1 細(xì)胞功能上發(fā)揮重要作用，其數(shù)量或功能缺陷會(huì)導(dǎo)致T 細(xì)胞介導(dǎo)自身免疫應(yīng)答加重膽管損傷［15-20］。本研究發(fā)現(xiàn)nTreg 和iTreg 在BA 肝纖維組中表達(dá)高于炎癥組，與既往實(shí)驗(yàn)性BA 研究結(jié)論一致。RRV 感染后小鼠BA 模型的細(xì)胞行為表明，當(dāng)小鼠在7 d 的生命中膽管損傷時(shí)，肝Treg 迅速增加10 倍，但在第1 天注射時(shí)未觀察到這種增加［20］?？赡芘c炎癥早期Treg 數(shù)量和功能不足導(dǎo)致無(wú)法控制炎癥破壞膽管有關(guān)。NKT 細(xì)胞在炎癥組中表達(dá)高于纖維化組，炎癥早期NKT 細(xì)胞作為先天性免疫應(yīng)答細(xì)胞迅速參與炎癥反應(yīng)，纖維化期Treg 增加受抑制后活性降低［20］。肝臟炎癥典型特征為重新募集主要由單核細(xì)胞、早期活化的促炎巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和NK 細(xì)胞組成的炎癥細(xì)胞庫(kù)，以上細(xì)胞損害肝血管結(jié)構(gòu)和功能，這些先天性免疫細(xì)胞首先被激活募集至肝臟損傷膽管細(xì)胞［21］。也有研究顯示嗜中性粒細(xì)胞可促進(jìn)肝臟炎癥和纖維化自發(fā)消退［22］。目前針對(duì)以上免疫細(xì)胞在BA中的具體作用機(jī)制尚不清楚。

本研究描繪了BA 發(fā)展免疫微環(huán)境的變化，但具有一定局限性，首先，本研究?jī)H揭示了不同病理分期BA 肝臟免疫微環(huán)境，無(wú)法在單細(xì)胞水平反映類(lèi)型和狀態(tài)，更為先進(jìn)的單細(xì)胞RNA 測(cè)序可揭示各獨(dú)立細(xì)胞的特異性。其次，本研究包括BA 肝臟樣本數(shù)較少，本身BA 肝臟炎癥和纖維化病理分期界限較為主觀，因此在評(píng)估BA 肝臟進(jìn)展中的免疫微環(huán)境方面可能存在偏差。最后，需進(jìn)行動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明免疫微環(huán)境在BA 發(fā)病及發(fā)展機(jī)制中的作用。

總之，本研究評(píng)估了BA 不同病理期浸潤(rùn)的免疫相關(guān)基因、免疫細(xì)胞及分子途徑激活水平，有助于闡明BA發(fā)病機(jī)制，為BA治療提供新的方向。