馬靜，路勝昔，景風(fēng)梅，夏莉

缺血性心臟病是心血管疾病死亡的重要原因，治療手段目前主要是恢復(fù)缺血區(qū)心肌的血液供應(yīng)，冠狀動(dòng)脈（冠脈）復(fù)灌后，可能會(huì)進(jìn)一步加重組織損傷，即出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷（I/R）[1-3]。探究心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制，探索如何減少心肌 I/R損傷具有重要的臨床意義[4]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制涉及氧自由基生成過(guò)多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎性反應(yīng)等[4]。和厚樸酚（honokiol，HKL）提取自玉蘭屬植物，HKL通過(guò)激活沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）/叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1）信號(hào)通路，抑制腦組織炎癥損傷和凋亡水平[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，HKL可改善甚至逆轉(zhuǎn)心肌肥大[6]，HKL通過(guò)激活SIRT1，緩解糖尿病狀態(tài)下心肌缺血再灌注損傷[7]。據(jù)此推測(cè)，HKL可能通過(guò)激活SIRT1/FOXO1自噬通路，抑制缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥發(fā)生。研究通過(guò)制備心肌缺血再灌注損傷小鼠模型，探究HKL對(duì)心肌缺血再灌注損傷小鼠的保護(hù)作用，探討其對(duì)SIRT1/FOXO1通路的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料C57BL6小鼠100只，3～6周齡體重20～30 g，北京生命科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SYXK（京）2015-0002。小鼠均自由攝食飲水，自然光照，恒溫25℃，濕度60%，通風(fēng)良好。本研究經(jīng)當(dāng)?shù)貏?dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。和厚樸酚（天津制藥集團(tuán)有限公司，貨號(hào)42612）；SIRT1 特異性抑制劑（EX527，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)E7034）；β-actin抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：4970）；SIRT1抗體（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：M1689）；小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA檢測(cè)試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)：20181235）；Ac-FOXO1（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，貨號(hào)：sc-49437）抗體；HE染色試劑盒（上海碧云天公司，貨號(hào)：C0105）、RIPA裂解液（上海碧云天公司，貨號(hào)：P00145）、BCA試劑盒（上海碧云天公司，貨號(hào)：P0011）。BL-420F生物信號(hào)采集與分析系統(tǒng)購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司；1659001蛋白電泳儀、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀、GelDocEZ凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模及給藥C57BL6小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)（Sham）組、模型組（MI/RI）組、和厚樸酚（HKL）組、EX527+和厚樸酚（HKL+EX527）組和EX527組，每組各20只。除假手術(shù)組外，其余各組均進(jìn)行心肌缺血再灌注損傷造模，具體步驟參照文獻(xiàn)[8]。小鼠術(shù)前禁食12 h，經(jīng)10%戊氯甲烷（0.1 ml/100 g腹腔注射）麻醉后，仰臥固定，于頸部正中2 cm作切口，分離肌肉制作氣管插管，連接呼吸機(jī)輔助呼吸，參數(shù)設(shè)定為潮氣量2～3 ml，吸入氧濃度為50%，呼吸頻率為60～70次/min。在胸骨正中左側(cè)縱向切口約2 cm，剪斷第3～4肋骨，擴(kuò)胸器迅速撐開(kāi)胸部，并于左心耳與動(dòng)脈圓錐交界下方2 mm處活結(jié)結(jié)扎前降支，當(dāng)供血區(qū)域顏色變暗和ST段抬高時(shí)，表明缺血模型制備成功。缺血45 min后，打開(kāi)活結(jié)，關(guān)閉胸腔，使心肌再灌注，以ST段逐漸恢復(fù)正常作為再灌注模型成功的標(biāo)志。假手術(shù)組僅開(kāi)胸，于小鼠左前降支根部穿線但不結(jié)扎。參照文獻(xiàn)[5]給藥，MI/RI組以生理鹽水腹腔注射給藥；HKL組于再灌注前15 min腹腔注射給予HKL 0.2 mg/kg；EX527組于缺血再灌注前20 min腹腔注射EX527 5 mg/mg；HKL+EX527組于再灌注前20 min腹腔同時(shí)注射給予HKL 0.2 mg/kg和EX527 5 mg/mg。

1.2.2 心肌組織含水量測(cè)定灌注3 h后，每組分別隨機(jī)選取10只小鼠，麻醉處死后快速摘除小鼠心臟，清除血跡，稱量心臟組織濕重，將心臟組織樣品在105℃烘箱中干燥48 h，直到心臟組織重量恒定。心臟組織水含水量=[（濕重-干重）/濕重]×100%。

1.2.3 HE染色觀察小鼠組織病理學(xué)變化灌注3 h后，將各組剩余10只小鼠麻醉處死，快速摘除心臟置于冰上，輕輕按壓排出心臟內(nèi)血液，在距心尖2 mm處沿橫向?qū)⑵淝虚_(kāi)，部分心臟組織于-80℃保存；其余放入組織固定液（4%多聚甲醛溶液）室溫固定72 h。固定后，將組織依次質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分別脫水5 min；蒸餾水沖洗后，一部分采用二甲苯透明處理，石蠟包埋后制成組織切片備用，另一部分采用蘇木素染色10 min，置于1%鹽酸5 s后，蒸餾水沖洗。滴加伊紅染液復(fù)染5 min，在不同濃度的乙醇溶液中脫水2 min，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，滴加中性樹(shù)脂封片，置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)心肌組織細(xì)胞中炎性因子IL-1β和TNF-α表達(dá)量取1.2.3項(xiàng)下冷凍心肌組織樣品，在50 mM Tris緩沖液中勻漿，4℃以12 000 r/min離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，使用ELISA試劑盒測(cè)定小鼠心肌組織中的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的濃度。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)心肌組織蛋白印跡表達(dá)量取1.2.3項(xiàng)下冷凍心肌組織樣品，在50 mM Tris緩沖液中勻漿，12 000r/min 4°C離心10 min，使用以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品的Micro BCA蛋白測(cè)定試劑盒，測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。將總蛋白（50 μg）進(jìn)行10%～12%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（PVDF），用5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜封閉2 h，以稀釋后的SIRT1(1∶1000)、Ac-FOXO1（1∶500）一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL 試劑盒說(shuō)明書(shū)配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)0.5 min，用Bio Rad成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白灰度信號(hào)，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件定量分析蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 TUNEL法檢測(cè)心肌組織中細(xì)胞凋亡情況將1.2.3項(xiàng)下制備好的心肌組織石蠟切片，用二甲苯及各梯度酒精脫蠟至水，使用無(wú)菌蒸餾水水化5 min后，用0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中進(jìn)行熱修復(fù)，分別經(jīng)過(guò)3%H2O2甲醇液、0.1%Triton X-100、20%牛血清、TUNEL 反應(yīng)混合液、POD轉(zhuǎn)化劑孵育及PBS沖洗后，DAB溶液顯色，并在顯微鏡下觀察，終止后用邁耶蘇木精染核，PBS沖洗后，甘油封片劑封片，顯微鏡下觀察并拍攝圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 和厚樸酚對(duì)各組小鼠心肌組織含水量影響與Sham組小鼠相比，MI/RI組、EX527+HKL組、EX527組小鼠心肌組織內(nèi)水含量均明顯增加（P＜0.05）。與MI/RI組比較，HKL組小鼠心肌組織內(nèi)水含量明顯降低（P＜0.05）；EX527組小鼠心肌組織內(nèi)水含量明顯增加（P＜0.05）。與HKL組比較，EX527組、EX527+HKL組小鼠心肌組織水含量均明顯增加（P＜0.05）。與EX527組比較，EX527+HKL組心肌組織內(nèi)水含量明顯降低（P＜0.05），表1。

表1 和厚樸酚對(duì)缺血再灌注心肌組織中含水量的影響

2.2 和厚樸酚對(duì)各組小鼠心肌組織病理變化的影響Sham組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，無(wú)病變特征。與sham組比較，MI/RI、EX527+HKL組、EX527組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌壞死嚴(yán)重，結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，且炎癥細(xì)胞大量浸潤(rùn)。與MI/RI組相比，HKL組小鼠上述病理?yè)p傷減輕，EX527組小鼠上述病理?yè)p傷加重。與HKL組比較，EX527組及EX527+HKL組上述病理?yè)p傷加重。與EX527組比較，EX527+HKL組小鼠心肌組織上述病理?yè)p傷減輕（圖1）。

圖1 小鼠心肌組織病理變化比較（HE染色，×100）

2.3 和厚樸酚對(duì)各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響與Sham組比較，MI/RI組EX527組、EX527+HKL小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。與MI/RI組比較，HKL組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05），Ex527組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。與HKL組比較，EX527組、EX527+HKL組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）。與EX527組比較，EX527+HKL組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率減少（P＜0.05），見(jiàn)圖2，表2。

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較

圖2 各組小鼠心肌細(xì)胞凋亡水平比較（TUNEL檢測(cè) ×200）

2.4 和厚樸酚對(duì)各組小鼠心肌組織中SIRT1/FOXO1蛋白表達(dá)的影響與Shame相比，MI/RI組小鼠心肌組織中SIRT1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Ac-FOXO1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與MI/RI組相比，HKL組小鼠心肌組織 SIRT1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Ac-FOXO1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；EX527組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Ac-FOXO1升高（P＜0.05）。與HKL組相比，HKL+EX527組、EX527組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Ac-FOXO1升高。與EX527組比較，HKL+EX527組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Ac-FOXO1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3，表3。

圖3 小鼠心肌組織中SIRT1、Ac-FOXO1蛋白表達(dá)免疫印跡圖

表3 和厚樸酚對(duì)各組小鼠心肌組織中 SIRT1 、Ac-FOXO1信號(hào)表達(dá)的影響

2.5 和厚樸酚對(duì)心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌組織中IL-1β、TNF-α水平的影響與Sham組比較，MI/RI組小鼠心肌組織中IL-1β、TNF-α水平明顯增高（P＜0.05）。與MI/RI組比較，HKL組小鼠心肌組織IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）；EX527組小鼠心肌組織 IL-1β、TNF-α水平明顯增高（P＜0.05）。與HKL組比較，HKL+EX527組、EX527組小鼠心肌組織IL-1β、TNF-α水平明顯增加（P＜0.05）；與EX527組比較，HKL+EX527組小鼠心肌組織IL-1β、TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），表4。

表4 和厚樸酚對(duì)缺血再灌注心肌組織中炎癥水平表達(dá)的影響

3 討論

心肌缺血再灌注損傷，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)加重、心肌壞死加重，探究缺血再灌注損傷分子機(jī)制，尋找新的有效的治療藥物是目前的重要任務(wù)[9,10]。和厚樸酚是中藥材中天然、安全的“靶向”藥物[6]。近年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)和厚樸酚對(duì)缺血再灌注損傷組織有保護(hù)作用，可減輕心室重構(gòu)[11,12]，本研究建立心肌缺血再灌注損傷小鼠模型，給予和厚樸酚、SIRT1抑制劑EX520處理，探究和厚樸酚減輕缺血再灌注心肌損傷的分子機(jī)制。

心肌缺血再灌注與多種炎癥因子密切相關(guān)，心肌應(yīng)激刺激心肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放 TNF-α，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，加重再灌注損傷[13]；心肌缺血再灌注損傷也與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，缺血再灌注損傷會(huì)加重心肌細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞的凋亡受特定基因調(diào)控，冠脈搭橋手術(shù)病人中，IL-1β的表達(dá)水平增高，將誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，從而加重缺血再灌注損傷[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠缺血再灌注損傷后，心肌組織細(xì)胞損傷嚴(yán)重、凋亡增加、含水量增大、炎性因子水平增多，給予和厚樸酚治療后，心肌組織細(xì)胞損傷緩解、凋亡率、含水量、炎性因子水平均相應(yīng)減少，表明和厚樸酚可緩解心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥損傷。與HKL組相比，HKL+EX527組小鼠心肌細(xì)胞損傷加劇、凋亡率、含水量、炎性因子水平均增加，提示抑制SIRT1可阻斷HKL對(duì)心肌缺血再灌注損傷小鼠的保護(hù)作用。

SIRT1具有顯著的心肌保護(hù)效應(yīng)[16]，其保護(hù)作用依賴于其脫乙?；钚訹14]，SIRT1活性的抑制，能顯著抑制缺血預(yù)處理的保護(hù)效應(yīng)[17,18]，研究表明，激活SIRT1可抑制炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，減輕腦缺血再灌注損傷[19-23]。SIRT1特異性抑制劑EX527，可增加凋亡細(xì)胞的數(shù)量[24]。本研究結(jié)果顯示，與Sham組相比，MI/RI組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)降低，Ac-FOXO1蛋白表達(dá)升高。與MI/RI組相比，HKL組小鼠心肌組織 SIRT1蛋白表達(dá)升高，Ac-FOXO1蛋白表達(dá)降低，提示和厚樸酚可能通過(guò)激活SIRT1/FOXO1通路發(fā)揮作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與HKL組相比，HKL+EX527組小鼠心肌組織SIRT1蛋白表達(dá)降低，Ac-FOXO1升高，表明抑制SIRT1可逆轉(zhuǎn)HKL對(duì)SIRT1/FOXO1通路的激活，提示HKL很可能通過(guò)激活SIRT1/FOXO1 通路發(fā)揮作用。

綜上所述，和厚樸酚可通過(guò)激活SIRT1/FOXO1通路，緩解心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌組織細(xì)胞的凋亡和炎癥損傷，這可能為其作用機(jī)制之一，為臨床心肌缺血再灌注損傷治療提供一定的參考。但本研究未深入研究和厚樸酚激活SIRT1 減輕心肌組織細(xì)胞損傷的復(fù)雜信號(hào)機(jī)制，存在一定不足，將在后續(xù)深入研究。