李潔，魯皓，劉柳，吳曉霞，李成，丁聰，李建科*

1(陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安,710119)2(陜西秦豆園農(nóng)業(yè)科技有限公司，陜西 咸陽,721000)

大豆富含維生素、異黃酮、蛋白質(zhì)、膳食纖維及不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，是人類主要的植物蛋白來源之一[1]。豆乳是大豆經(jīng)過加工后獲得的一種飲料，因其具有獨特的風(fēng)味、營養(yǎng)物質(zhì)豐富且易吸收而深受大眾喜歡。對于營養(yǎng)不良的人群以及牛奶供應(yīng)不足的人群來說，豆乳蛋白的營養(yǎng)價值高且更容易被人體吸收[2]。益生菌為一類對機體有益的活性微生物，可以平衡機體腸道內(nèi)菌群，同時也可以產(chǎn)生活性物質(zhì)，促進人體健康[3]。乳酸菌是一類存在于人體胃腸道中的多效益生菌，可以降低膽固醇水平，具有抵抗低酸堿度和高膽鹽的能力，研究價值非常高[4]。發(fā)酵豆乳由滅菌豆乳經(jīng)過益生菌發(fā)酵而形成，其具有豆香味，保留了豆乳原有營養(yǎng)價值的同時減少了高脂飲食引起的高脂血癥和肝損傷[5]，可改善低聚糖的消化率[6-7]，同時減少草酸、植酸、蛋白酶抑制劑、脲酶等抗?fàn)I養(yǎng)成分[8-9]。此外，通過益生菌的發(fā)酵，可將結(jié)合型的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為更易被人體消化吸收的游離型大豆異黃酮[10-11]。大豆異黃酮被稱為天然植物雌激素，雖然對機體健康有益，但主要是以結(jié)合態(tài)的大豆異黃酮存在，即為糖苷形式，難以被人體消化吸收[12]。當(dāng)人體攝入含有大豆異黃酮的食物后，游離型的大豆異黃酮可直接在小腸被吸收，而結(jié)合型的大豆異黃酮則在腸道中被β-葡萄糖苷酶水解，轉(zhuǎn)化成游離型的苷元從而被機體消化吸收，因此游離型的大豆異黃酮消化吸收率更高[13]。同時其在預(yù)防骨質(zhì)疏松、心血管疾病、神經(jīng)保護和抗腫瘤等疾病方面有一定的生理功效。并且大豆異黃酮苷元具有較高的市場價格，因此提高豆類食品中苷元類物質(zhì)的含量，增加大豆異黃酮資源的利用度，對保健食品的開發(fā)具有重要意義。

本實驗為探究益生菌在全豆乳發(fā)酵中對結(jié)合態(tài)大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化，以干酪乳桿菌(Lacticaseibacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)分別發(fā)酵全豆乳，以發(fā)酵豆乳的pH值降到4.5為發(fā)酵終點，測定發(fā)酵期間pH值、滴定酸度、活菌數(shù)、表觀黏度、游離氨基氮和大豆異黃酮含量的變化，并對發(fā)酵產(chǎn)品進行感官評價，為益生菌發(fā)酵豆乳的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌(Lacticaseibacilluscasei)CICC 23488、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CICC 22696，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)BNCC 185342，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素標(biāo)準(zhǔn)品均為HPLC級，西安晶博生物科技有限公司，含量≧98%。實驗所有水均為由Q-Grad?超純水系統(tǒng)制備的超純水(18.2 MΩ)；其他試劑均為分析純及以上級別，Sigma-Aldrich。

全豆乳產(chǎn)品，陜西秦豆園農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)并提供。

1.1.2 儀器設(shè)備

HWS智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；HaierBCD-206T冰箱，青島海爾股份有限公司；VisionPlus pH6178 pH劑，安徽賽科環(huán)?？萍加邢薰?；YUEJIN超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHIMADZU高效液相色譜，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；TGL-16 gR高速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BROOKFIELD DV-E型黏度計，上海一恒科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化與菌懸液制備

將-80 ℃保存的L.casei、L.acidophilus和L.plantarum分別培養(yǎng)在MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，12 h。為了確保益生菌生長活力達到良好的狀態(tài)，按照活化培養(yǎng)液體積分數(shù)為3%的接種量連續(xù)傳代3次。每次使用前各菌株均在MRS肉湯培養(yǎng)基中活化2代。以上操作均在超凈工作臺中完成。取10 mL活化培養(yǎng)的種子液制成108CFU/mL菌懸液。

1.2.2 全豆乳的制作工藝

選料篩選(精選非轉(zhuǎn)基因大豆，顆粒飽滿)→浸泡、煮豆→制漿→均質(zhì)→罐裝→殺菌(超高溫、短時連續(xù)殺菌)→冷卻→4 ℃保藏

1.2.3 發(fā)酵全豆乳的制備

取300 mL按1.2.2制作的全豆乳平均分裝于3個無菌錐形瓶中，按照3%(體積分數(shù)，下同)接種量分別將L.casei、L.acidophilus和L.plantarum接種于分裝的全豆乳中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，37 ℃條件下發(fā)酵至終點，將發(fā)酵好的全豆乳于4 ℃冷藏備用。

1.2.4 益生菌在全豆乳中的發(fā)酵特性及活性物質(zhì)的含量變化

取300 mL全豆乳平均分裝于3個無菌錐形瓶中，以3%接種量分別將L.casei、L.acidophilus和L.plantarum接種于分裝的全豆乳中，用無菌玻璃棒攪拌均勻，37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定其pH值、滴定酸度、表觀黏度直至發(fā)酵結(jié)束(pH 4.5)，測定發(fā)酵豆乳活菌數(shù)、游離氨基氮、大豆異黃酮含量。

1.2.4.1 主要理化指標(biāo)的測定

水分的測定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》，以直接干燥法進行測定；灰分的測定參考 GB 5009.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》，以灼燒重量法進行測定；脂肪含量的測定參考GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》，以索氏抽提法進行測定；蛋白質(zhì)含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》，以凱氏定氮法進行測定。

pH值用pH計在室溫下檢測；滴定酸度：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵全豆乳樣品5 g于100 mL錐形瓶中，加入40 mL超純水，用玻璃棒攪拌均勻，加入2～3滴酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至微紅色且30 s內(nèi)顏色不消失。滴定酸度(吉爾涅爾度°T)為100 mL發(fā)酵豆乳消耗 0.1 mol/L NaOH的體積(mL)。消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH相當(dāng)于1 °T。

表觀黏度使用BROOKFIELD DV-E型黏度計測定發(fā)酵全豆乳黏度；游離氨基氮參考CHURCH等[14]的方法，用鄰苯二甲醛衍生比色法測定。

1.2.4.2 活菌計數(shù)

取一定量的發(fā)酵全豆乳，用無菌水進行梯度稀釋，然后選取稀釋10-5、10-6、10-7倍的發(fā)酵全豆乳用平板傾注法測定活菌數(shù)。37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，記錄菌落總數(shù)，用CFU/mL表示。

1.2.4.3 感官評定

參照文獻[15]的方法，邀請從事食品研究的人員男女各5名進行感官評定，每次品嘗需在口中細細品味5 s以上并用舌頭攪動發(fā)酵全豆乳。分別從組織狀態(tài)、氣味、口感和質(zhì)地打分，每次品嘗前需充分漱口，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 感官評分表Table 1 Sensory evaluation standard

1.2.4.4 發(fā)酵豆乳中大豆異黃酮含量的測定

參照 GB/T 23788—2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法》。

樣品預(yù)處理：取發(fā)酵豆乳5 mL于50 mL容量瓶，加入80%(體積分數(shù)，下同)甲醇溶液至接近刻度線，然后以100 W功率超聲振蕩40 min。超聲結(jié)束后用80%甲醇定容，搖勻。取適量樣品溶液以8 160 r/min離心15 min。將上清液過0.45 μm濾膜后備用。

HPLC色譜條件：色譜柱：ZORBAXSB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：乙腈；流動相B：0.5%甲酸超純水。流速1 mL/min；波長260 nm；進樣量20 μL；柱溫30 ℃。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedures

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗至少重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±SD”表示。采用SPSS 15.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，Origin 7.0軟件繪圖。文中上標(biāo)字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 全豆乳主要理化指標(biāo)的測定結(jié)果

本實驗制備的全豆乳水分含量為81.49%，灰分、脂肪和蛋白質(zhì)含量分別為1.15%、2.78%和4.35%。

2.2 三株益生菌對全豆乳的發(fā)酵特性

2.2.1 全豆乳發(fā)酵過程中pH值的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發(fā)酵全豆乳，每隔2 h測定發(fā)酵期間的pH值至發(fā)酵終點，結(jié)果如圖1所示。

圖1 三株益生菌發(fā)酵全豆乳pH值的變化Fig.1 Changes in pH value of whole soymilk fermented by three probiotics

L.casei和L.plantarum發(fā)酵全豆乳pH值下降的速度較快，而L.acidophilus發(fā)酵全豆乳在0～7 h時pH值下降緩慢，7～14 h時呈快速下降趨勢。其中，L.casei發(fā)酵全豆乳到達終點(pH 4.5)用時最短，為7 h；而L.acidophilus發(fā)酵全豆乳到達終點用時最長，為20 h，這可能是由于其蛋白水解能力較弱造成的。CHURCH等[14]用單一益生菌發(fā)酵豆乳，結(jié)果顯示達到發(fā)酵終點用時較長，與本研究所得結(jié)論基本一致。

2.2.2 全豆乳發(fā)酵過程中滴定酸度值的變化

由圖2可知，L.acidophilus發(fā)酵全豆乳在0～6 h時滴定酸度值變化緩慢，然后呈現(xiàn)快速上升趨勢。L.plantarum發(fā)酵全豆乳在發(fā)酵結(jié)束時滴定酸度值最高，為66.17 °T，與L.acidophilus發(fā)酵全豆乳滴定酸度值沒有顯著差異。而L.casei發(fā)酵全豆乳在發(fā)酵結(jié)束時滴定酸度值顯著低于其他益生菌發(fā)酵的樣品(P<0.05)，為32.83 °T。

圖2 三株益生菌發(fā)酵全豆乳滴定酸度值的變化Fig.2 Changes in titration acidity of whole soymilk fermented by three probiotics

2.2.3 全豆乳發(fā)酵過程中表觀黏度的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發(fā)酵全豆乳，每隔2 h測定發(fā)酵期間的黏度值至發(fā)酵終點，結(jié)果如圖3所示。

圖3 三株益生菌發(fā)酵全豆乳黏度的變化Fig.3 Changes in viscosity of whole soymilk fermented by three probiotics

3株益生菌發(fā)酵全豆乳黏度呈現(xiàn)快速上升趨勢，發(fā)酵結(jié)束時均在1.0～1.4 Pa·s，其中L.casei發(fā)酵全豆乳黏度略微高于其他益生菌，為1.397 Pa·s。L.casei發(fā)酵全豆乳表觀黏度在短時間內(nèi)快速上升，這可能是由于益生菌的快速增殖使得乳酸含量升高，大豆蛋白凝固形成酸凝膠，導(dǎo)致黏度迅速增加[16]。其他2種菌發(fā)酵全豆乳的表觀黏度變化比較平緩，這與它們較長的發(fā)酵時間相吻合，表明這2種菌增殖速度相對較慢，相應(yīng)的乳酸含量增加也較慢，表觀黏度也因此呈現(xiàn)平緩上升的趨勢。

2.2.4 全豆乳發(fā)酵起始和結(jié)束時的活菌數(shù)

發(fā)酵乳制品中活菌數(shù)須在106CFU/mL以上且能在腸道中存活才能發(fā)揮其益生特性[17]。由表3可知，發(fā)酵結(jié)束時，3株益生菌發(fā)酵全豆乳活菌數(shù)均顯著升高(P<0.05)，均>108CFU/mL。其中，L.casei發(fā)酵全豆乳到達發(fā)酵終點時活菌數(shù)最高為2.03×109CFU/mL。這可能是因為發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些碳源如水蘇糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖等，這些物質(zhì)可作為發(fā)酵菌的能量來源，加速了發(fā)酵菌的生長增殖。

表3 發(fā)酵起始和結(jié)束時的活菌數(shù) 單位：lg CFU/mL

2.2.5 全豆乳發(fā)酵過程中游離氨基氮的變化

分別以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum發(fā)酵全豆乳，測定發(fā)酵結(jié)束時的游離氨基氮的含量，結(jié)果如圖4所示。發(fā)酵結(jié)束時，L.acidophilus的蛋白質(zhì)水解能力最強，其發(fā)酵結(jié)束時游離氨基氮的含量為3.09 mmol/L。而L.casei的蛋白質(zhì)水解能力較其他2株菌弱，發(fā)酵結(jié)束時游離氨基氮的含量為2.39 mmol/L。其可能原因是發(fā)酵時間越長，全豆乳中大豆蛋白水解越徹底。菌株的類型和發(fā)酵時間可能影響蛋白水解的活性[18]。此結(jié)論與本研究結(jié)果基本一致。

圖4 三株益生菌發(fā)酵全豆乳游離氨基氮的變化Fig.4 Changes of free amino nitrogen in whole soymilk fermented by three probiotics

2.2.6 感官評定

圖5為發(fā)酵結(jié)束后于4 ℃冰箱貯藏12 h后全豆乳的感官評價結(jié)果。由圖5可知，L.casei發(fā)酵全豆乳感官評分最高，L.plantarum次之，L.acidophilus最低。L.casei發(fā)酵全豆乳具有外觀光滑緊致、色澤柔和、產(chǎn)品形狀保持較好的特點。雖有少量乳清析出，但酸甜比例適宜、口感細膩、無豆腥味、味道可口，符合大眾口味。因此，L.casei更適合發(fā)酵有良好口感的豆乳，開發(fā)出暢銷大眾的新產(chǎn)品。

圖5 三株益生菌發(fā)酵全豆乳感官評分Fig.5 Sensory scores of whole soymilk fermented by three probiotics

2.3 三株益生菌發(fā)酵全豆乳中大豆異黃酮的含量

2.3.1 原全豆乳中大豆異黃酮含量的測定

大豆異黃酮類物質(zhì)中主要包括大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素等活性成分。通過益生菌發(fā)酵將大豆中糖苷形式的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元形式的大豆異黃酮，可極大增加其消化吸收率。

如圖6所示，原全豆乳主要含大豆苷和染料木苷，含量分別為67.30、104.6 μg/mL，苷元和染料木素的含量較少，分別為3.13、2.43 μg/mL。這與大豆異黃酮中，苷元占2%～3%，糖苷占97%～98%的結(jié)果一致[12]。

圖6 原全豆乳中大豆異黃酮含量Fig.6 Soy isoflavone content in original whole soymilk

2.3.2 大豆苷和大豆苷元在全豆乳發(fā)酵期間的變化

由圖7-a可知，L.casei和L.acidophilus發(fā)酵全豆乳中大豆苷含量在發(fā)酵結(jié)束時顯著下降(P<0.05)，L.plantarum發(fā)酵全豆乳中大豆苷含量在發(fā)酵前后沒有顯著差異(P>0.05)。而圖7-b顯示3株益生菌發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量在發(fā)酵前后均顯著上升(P<0.05)。其中，L.casei發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量為6.23 μg/mL，是原全豆乳的2.0倍；L.acidophilus發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量為5.73 μg/mL，是原全豆乳的1.8倍；L.plantarum發(fā)酵全豆乳中大豆苷元含量最高，為9.59 μg/mL，是原全豆乳的3.1倍。說明L.plantarum能夠很好地分解糖苷型大豆苷，生成游離型的大豆苷元。

a-大豆苷含量；b-大豆苷元含量圖7 三株益生菌發(fā)酵全豆乳大豆苷和大豆苷元的變化Fig.7 Changes of daidzin and daidzein of whole soymilk fermented by three probiotics

2.3.3 染料木苷和染料木素在全豆乳發(fā)酵期的變化

由圖8-a可知，3株益生菌發(fā)酵全豆乳中染料木苷含量在發(fā)酵結(jié)束時均有下降，其中L.acidophilus發(fā)酵全豆乳中染料木苷含量下降最明顯，下降了13.1%。而圖8-b顯示，3株益生菌發(fā)酵全豆乳中染料木素的含量經(jīng)發(fā)酵后顯著上升(P<0.05)，其含量分別增加到12.97、8.57、18.73 μg/mL，分別是原全豆乳的5.3、3.5、7.7倍。其中，L.plantarum發(fā)酵全豆乳中染料木素含量最高。這與發(fā)酵過程苷類物質(zhì)水解為對應(yīng)苷元物質(zhì)的結(jié)論一致[19]。

a-染料木苷含量；b-染料木素含量圖8 三株益生菌發(fā)酵全豆乳染料木苷和染料木素的變化Fig.8 Changes of genistein and genistein of whole soymilk fermented by three probiotics

3 結(jié)論

本研究以L.casei、L.acidophilus和L.plantarum分別發(fā)酵全豆乳，以pH值降到4.5為發(fā)酵終點。發(fā)酵期間，3株益生菌發(fā)酵全豆乳pH值顯著下降，而滴定酸度和表觀黏度均顯著升高(P<0.05)。L.acidophilus發(fā)酵全豆豆乳到發(fā)酵終點用時最長，為20 h，大豆蛋白水解徹底，所以游離氨基氮含量最高，為3.09 mmol/L。發(fā)酵結(jié)束時，3株益生菌發(fā)酵全豆豆乳的活菌數(shù)均>108CFU/mL。

L.casei發(fā)酵全豆乳具有外觀光滑緊致、色澤柔和、產(chǎn)品形狀保持較好的特點。雖有少量乳清析出，但酸甜比例適宜，無豆腥味，味道可口，符合大眾口味，適合用于發(fā)酵出具有良好口感的豆乳。

發(fā)酵全豆乳大豆苷元、染料木素含量較原全豆乳中有顯著升高(P<0.05)。其中，L.plantarum發(fā)酵全豆豆乳中大豆苷元和染料木素含量最高，為9.59、18.73 μg/mL，分別是原全豆乳的3.1、7.7倍。因此L.plantarum發(fā)酵豆乳可顯著提高結(jié)合態(tài)大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化效率，提高了游離態(tài)大豆異黃酮的含量，從而增加人體對大豆異黃酮的消化吸收率，具有更高的營養(yǎng)保健價值。