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        超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紅美人中8種酚酸化合物

        2022-05-17 09:51:14張今君夏慧麗方如意
        食品研究與開(kāi)發(fā) 2022年9期
        關(guān)鍵詞:酚酸綠原甲酸

        張今君,夏慧麗,方如意

        (臺(tái)州市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,浙江 臺(tái)州 318000)

        紅美人又名愛(ài)媛28,是引自日本的雜柑類(lèi)品種[1],近年來(lái)在浙江、福建、江西等多地引種。在試點(diǎn)栽培過(guò)程中發(fā)現(xiàn),紅美人在結(jié)果習(xí)性、外觀、品質(zhì)等方面表現(xiàn)較為突出,成為各地主推的柑橘新品種之一。目前紅美人在市場(chǎng)定價(jià)、果品質(zhì)量存在一定的差異,人們對(duì)紅美人果品質(zhì)量的判斷也大都停留在外觀、口感等感官評(píng)價(jià)上,隨著社會(huì)發(fā)展和生活水平的提高,消費(fèi)者除了追求口感品質(zhì),對(duì)功能性品質(zhì)的需求日益增加。目前與紅美人相關(guān)的文獻(xiàn)多集中在不同產(chǎn)地的引種表現(xiàn)及栽培技術(shù)的研究[2-5],而有關(guān)紅美人中功能性成分研究甚少,對(duì)于果品等級(jí)劃分缺乏科學(xué)評(píng)價(jià)依據(jù)。

        酚酸是結(jié)構(gòu)中帶有酚類(lèi)基團(tuán)和有機(jī)羧酸官能團(tuán)的化合物[6],具有潛在的抗氧化、抗病毒、抗菌消炎等多種生物活性[7-9],是紅美人品質(zhì)指標(biāo)之一,也是重要的功能性成分。因此,測(cè)定及分析紅美人中酚酸物質(zhì)含量及組成,對(duì)評(píng)價(jià)紅美人果實(shí)品質(zhì)、挖掘功能性成分具有重要意義。目前柑橘中酚酸的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法[10-13]和超高效液相色譜法[14-15],高效液相色譜法具有易操作、靈敏度高和穩(wěn)定性好等特點(diǎn),但存在溶劑用量大、分離度差、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn);超高效液相色譜法采用超高壓技術(shù),具有高效、分離度高的優(yōu)勢(shì),但不能對(duì)所檢物質(zhì)準(zhǔn)確定性。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法既能發(fā)揮色譜法的高分離能力,又能發(fā)揮質(zhì)譜法的高鑒別能力,更適用多種酚酸的定量定性分析[16-21]。本文以浙江省6個(gè)產(chǎn)區(qū)的紅美人柑橘為研究對(duì)象,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定紅美人中酚酸化合物的含量,分析酚酸化合物的組成和含量,以期為紅美人品質(zhì)評(píng)價(jià)及功能性成分挖掘提供數(shù)據(jù)參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        紅美人柑橘:來(lái)源于寧波象山、麗水蓮都、衢州衢江、臺(tái)州黃巖、溫嶺和臨海6個(gè)主要生產(chǎn)基地。分別從每個(gè)基地隨機(jī)采集無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷且成熟度基本一致的樣品6份,-18℃冷凍保存。

        沒(méi)食子酸、原爾茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸、咖啡酸等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):加拿大多倫多研究化學(xué)品公司;乙腈、甲醇、甲酸(均為色譜純):美國(guó)Thermo Fisher公司;鹽酸、氫氧化鈉、抗壞血酸、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)(均為分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;Oasis HLB 小柱(6 mL/200 mg):美國(guó)Waters公司。

        1.1.2 儀器與設(shè)備

        QTRAP 4500三重四極桿-線性離子肼質(zhì)譜系統(tǒng):美國(guó)AB Sciex公司;UPLC液相色譜系統(tǒng):日本島津公司;Allegra X-30R冷凍離心機(jī):美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司;KS4000ic可控溫振蕩箱、VORTEX 3渦旋混勻器:德國(guó)IKA公司;2150 TH超聲波儀:上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;PR 1602 ZH/Z電子天平:奧豪斯儀器(上海)有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

        準(zhǔn)確稱(chēng)取每種標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg(精確至0.1 mg),分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,配制成濃度為2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(-18℃保存)?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液:準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各25 μL置于10 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,配制成濃度均為5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。配制合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),化合物峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

        1.2.2 樣品前處理

        準(zhǔn)確稱(chēng)取紅美人果肉2.00 g于50 mL離心管中,加入20 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液(含1%抗壞血酸和10 mmol/L EDTA),40℃避光振蕩水解2 h,離心吸取10 mL,用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2,提取液轉(zhuǎn)入經(jīng)過(guò)預(yù)先處理的Oasis HLB小柱,棄去濾液,用5 mL甲醇分兩次清洗固相萃取小柱,加甲醇定容至5.0 mL,混勻,過(guò)0.22 μm濾膜,上機(jī)測(cè)試。

        1.2.3 儀器條件

        色譜條件:Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100mm×2.1mm,1.7μm),柱溫 35℃;流速 300 μL/min;進(jìn)樣體積5 μL;流動(dòng)相:A為含0.01%甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

        表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution of condition

        質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI源);負(fù)離子掃描(ESI-);多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple re action monitoring,MRM);電噴霧電壓(ion spray,IS)5 500 V;霧化氣壓力(gas of nebulizer,GS1)0.34 MPa;輔助氣壓力(gas of heater,GS2)0.34 MPa;氣簾氣壓力(curtain,CUR)0.24MPa;離子源溫度(temperature,TEM)550℃,各化合物定性離子、定量離子對(duì)及其碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表2。

        表2 化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The mass spectrum parameters of compound

        續(xù)表2 化合物的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 2 The mass spectrum parameters of compound

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        譜圖在SCIEX OS-Q軟件上處理,采用離子比及保留時(shí)間進(jìn)行定性確證,外標(biāo)法計(jì)算各組分含量。數(shù)據(jù)使用Micro-softExcel 2007軟件進(jìn)行處理。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

        參照NY/T 3290-2018《水果、蔬菜及其制品中酚酸含量的測(cè)定液質(zhì)聯(lián)用法》[16]對(duì)紅美人中的酚酸進(jìn)行檢測(cè)。紅美人中游離型、游離酯型、結(jié)合酯型3類(lèi)酚酸均有檢出,其中游離酯型、結(jié)合酯型酚酸需水解提取。本文通過(guò)比較不同濃度、不同體積NaOH溶液優(yōu)化水解條件。取紅美人樣品9份,分別加入20 mL 2、4、6 mol/L NaOH溶液,每個(gè)濃度測(cè)定3次,結(jié)果見(jiàn)圖1。

        圖1 不同濃度NaOH溶液中酚酸的含量Fig.1 Content of phenolic acids in different concentration of NaOH solution

        由圖1可知,沒(méi)食子酸、原爾茶酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸在2 mol/L NaOH溶液水解時(shí)含量略高,對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、芥子酸在6 mol/L NaOH溶液水解時(shí)含量略高,各目標(biāo)化合物在3個(gè)濃度下含量變化不大,綜合考慮選擇2 mol/L NaOH溶液進(jìn)一步考察不同體積NaOH溶液對(duì)水解效率的影響。

        稱(chēng)取紅美人樣品 15份,分別加入 5、10、15、20、25 mL 2 mol/L NaOH溶液,每個(gè)體積測(cè)定3次,按1.2.2方法對(duì)樣品進(jìn)行處理,各目標(biāo)物結(jié)果見(jiàn)圖2。

        圖2 不同體積NaOH溶液中酚酸的含量Fig.2 Content of phenolic acids in different volume of NaOH solution

        由圖2可知,在5 mL~20 mL范圍內(nèi)沒(méi)食子酸、原爾茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸測(cè)定含量隨NaOH溶液體積增加,在20 mL時(shí)含量最高,因此本文選擇2 mol/L、20 mLNaOH溶液對(duì)樣品進(jìn)行水解提取。

        2.2 儀器條件優(yōu)化

        2.2.1 色譜條件

        選用HSS T3色譜柱對(duì)9種酚酸進(jìn)行分離[16-17]。流動(dòng)相通過(guò)對(duì)比乙腈/水、乙腈/0.1%甲酸水、乙腈/0.01%甲酸水3種類(lèi)型進(jìn)行比較優(yōu)化。結(jié)果顯示,在乙腈/水體系中所有組分在3 min出峰,保留時(shí)間短且峰型拖尾;在乙腈/0.01%甲酸水、乙腈/0.1%甲酸水流動(dòng)相中各目標(biāo)化合物分離良好且峰型尖銳。這是因?yàn)榉铀峄衔镏泻?OH和-COOH,加入甲酸能有效調(diào)節(jié)酚酸化合物解離,改善峰型,提高化合物在色譜柱上的保留。另外酚酸化合物負(fù)離子掃描模式下,水中甲酸增加至0.1%時(shí)會(huì)導(dǎo)致各目標(biāo)化合物信號(hào)降低,因此本試驗(yàn)選擇乙腈/0.01%甲酸水對(duì)樣品進(jìn)行洗脫。3種不同流動(dòng)相條件下的總離子流圖見(jiàn)圖3。

        圖3 3種不同流動(dòng)相條件下的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms under 3 mobile phases

        2.2.2 質(zhì)譜條件

        將0.1 μg/mL各標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)蠕動(dòng)泵以7 μL/min流速進(jìn)入ESI源進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過(guò)Q1全掃模式獲得分子離子峰,用子離子模式對(duì)分子離子峰進(jìn)行分析,從打碎的離子中選取兩個(gè)特征離子作為定性和定量離子。用MRM掃描模式優(yōu)化去簇電壓(declustering potential,DP)和碰撞能量(collision energy,CE)值,使得定量與定性離子強(qiáng)度響應(yīng)最大,優(yōu)化后的9種酚酸化合物質(zhì)譜參數(shù)(表2)。

        2.3 方法學(xué)考察

        2.3.1 線性范圍、檢出限、定量限、精密度、穩(wěn)定性

        配制不同濃度梯度的酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3.3儀器條件上機(jī)測(cè)試,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù);以3倍和10倍信噪比確定化合物的檢出限和定量限。取200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行6次,計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD),考察精密度;取同一份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)試,計(jì)算峰面積RSD,考察穩(wěn)定性。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

        表3 9種酚酸的相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、精密度及穩(wěn)定性Table 3 Correlated coefficient、precision、stability、detection and quantification limit of 8 kinds of phenolic acids

        由表 3可知,9種酚酸在 5 μg/L~5 000 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(r)≥0.999 1,檢出限濃度范圍為0.05 μg/L~0.73 μg/L,定量限的濃度范圍為0.17 μg/L~2.44 μg/L。9 種酚酸化合物的精密度為1.3%~3.0%,穩(wěn)定性為1.9%~3.9%。

        2.3.2 回收率及重復(fù)性

        稱(chēng)取6份已知含量的樣品2.00 g,添加5.0 μg/g阿魏酸及0.5 μg/g另外7種酚酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算目標(biāo)化合物的回收率和RSD,具體結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 8種酚酸回收率及重復(fù)性Table4 Recovery rate and repeatability of 8 kinds of phenolic acids

        由表4可知,8種酚酸化合物回收率為85.7%~103.9%、重復(fù)性為0.92%~5.28%。

        2.4 6個(gè)產(chǎn)地紅美人果肉中酚酸的組成和含量

        各產(chǎn)地紅美人中8種酚酸含量見(jiàn)表5。

        表5 6個(gè)產(chǎn)地紅美人中酚酸的組成和含量Table 5 Content and composition of phenolic acids in Hongmeiren from 6 origins

        續(xù)表5 6個(gè)產(chǎn)地紅美人中酚酸的組成和含量Continue table 5 Content and composition of phenolic acids in Hongmeiren from 6 origins

        由表5可知,樣品中均檢出沒(méi)食子酸、原爾茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、芥子酸,8 種酚酸的總量為 68.82 μg/g~98.96 μg/g,其中阿魏酸含量最高,為 38.02 μg/g~53.79 μg/g,占總酚酸50%以上,綠原酸含量次之,為 15.84 μg/g~25.90 μg/g,其余6種酚酸含量較低,分別為沒(méi)食子酸0.05 μg/g~0.12 μg/g、原爾茶酸 1.01 μg/g~1.81 μg/g、對(duì)羥基苯甲酸0.77 μg/g~1.38 μg/g、香草酸 1.43 μg/g~2.72 μg/g、對(duì)香豆酸 6.38 μg/g~11.00 μg/g、芥子酸 2.00 μg/g~6.95 μg/g。分析發(fā)現(xiàn),各產(chǎn)地紅美人中酚酸組成比例基本穩(wěn)定,其中阿魏酸占比均在51.10%~57.51%,綠原酸占比均在22.29%~27.86%。

        3 結(jié)論

        研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定紅美人中8種酚酸的檢測(cè)方法,方法采用NaOH溶液水解提取樣品中游離酯型、結(jié)合酯型酚酸,使紅美人中酚酸測(cè)定更加全面。該方法準(zhǔn)確可靠、靈敏度高,適合紅美人中酚酸的定性和定量檢測(cè),可推廣應(yīng)用于其他柑橘中酚酸含量的測(cè)定。

        利用建立的方法對(duì)浙江省6個(gè)產(chǎn)區(qū)的紅美人進(jìn)行測(cè)定,樣品中均檢出沒(méi)食子酸、原爾茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、香草酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸及芥子酸,酚酸含量豐富,其中阿魏酸含量最高,綠原酸次之。酚酸的組成和含量分析為后續(xù)紅美人功能成分的開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

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