于建麗，王汝華，孟琬星，梁增瀾，3，宋璇，孔宇，陸旸，尹吉泰，李超，

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市食品研究所有限公司，天津 301609；3.北京國(guó)貿(mào)東孚工程科技有限公司，北京 100032；4.天津食品集團(tuán)有限公司，天津 300074）

桑科植物桑（Morus alba L.）在中國(guó)各地被廣泛種植，且產(chǎn)量較高。2002年桑葉被中國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為藥食同源食品[1]。桑葉中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類，生物堿類等[2]。其中黃酮類化合物是桑葉的重要活性成分，并在其食療功效中起著關(guān)鍵作用[3]。桑葉黃酮（mulberry leaves flavone，MLF）具有抗氧化[4]、降糖降脂[1]、抑菌[5]等功效，是極具潛力的功能性食品產(chǎn)品添加劑。

目前，桑葉乙醇-水提取物中黃酮類化合物的提取率較高，但成分復(fù)雜，分離難度較大，多采用有機(jī)溶劑萃取法配合大孔吸附樹脂柱層析法進(jìn)行分離純化。有機(jī)溶劑萃取法雖然對(duì)于不同極性的物質(zhì)分離效果明顯，但有機(jī)溶劑殘留會(huì)阻礙活性物質(zhì)的應(yīng)用[6]。而雙水相（aqueous two-phase system，ATPS）萃取技術(shù)則是利用親水有機(jī)溶劑與離子液體在水溶液中分相，根據(jù)被分離物在兩相中溶解度的差異進(jìn)行分離，并能夠保持良好的生物活性[7]。因其具有分相清晰、綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)便、萃取率高等優(yōu)點(diǎn)[8]，近年來(lái)雙水相萃取在天然產(chǎn)物分離方面被廣泛研究應(yīng)用[9]。

因此，本研究探究乙醇-無(wú)機(jī)鹽雙水相體系對(duì)桑葉黃酮的分離純化效果及其對(duì)體外抗氧化活性的影響，以期為桑葉黃酮作為抗氧化劑添加劑應(yīng)用于食品領(lǐng)域提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：采摘自天津薊州山區(qū)。

九水合硝酸鋁、硫酸鉀、硫酸銨、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；磷酸氫二鉀、無(wú)水碳酸鈉、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠；亞硝酸鈉、氯化鈉、三氯乙酸、氯化鐵（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；AB-8大孔吸附樹脂、還原型輔酶Ⅰ二鈉（NADH-Na2）、氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitroblue-tetrazolium，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methyl sulfate，PMS）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ2200v超聲波處理器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；IKA RV 8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瓦恩默電器股份有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；TGL-21高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉黃酮粗提物的制備

新鮮桑葉50℃溫度烘干4 h，干燥粉碎，過(guò)60目篩。根據(jù)前期提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，選擇84%乙醇溶液、料液比1∶8（g/mL）、提取溫度50℃、提取時(shí)間30 min/次，超聲輔助提取3次，離心合并上清液，得到桑葉黃酮粗提物（mulberry flavone extract，MFE）。

1.3.2 總黃酮的測(cè)定

參照孫雪皎等[10]的黃酮檢測(cè)方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為 y=1.1288x-0.0042（R2=0.9995）。

1.3.3 雙水相成相研究

選擇無(wú)水乙醇為有機(jī)相，氯化鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鉀和硫酸銨作為試驗(yàn)無(wú)機(jī)鹽，采用濁點(diǎn)滴定法[11]繪制雙水相系圖。

1.3.4 雙水相萃取單因素試驗(yàn)

根據(jù)雙水相系圖，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇25%、30%、35%、40%、45%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別選擇5%、10%、15%、20%、25%，MFE 添加量分別選擇 2、4、6、8、10 mg/mL進(jìn)行單因素試驗(yàn)。室溫25℃下，溶解混勻，3 000 r/min離心10 min，分液，計(jì)算相比R、分配系數(shù)K、萃取率Y，計(jì)算公式如下。

式中：V1、V2分別為上、下相的體積，mL；C1、C2分別為上下相的總黃酮濃度，mg/mL。

1.3.5 雙水相萃取響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)萃取工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化。分別選定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MFE添加量作為響應(yīng)面的3個(gè)因素，以桑葉黃酮萃取率Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析和優(yōu)化，各因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)Table 1 Box-Behnken response surface design

1.3.6 大孔吸附樹脂純化

使用AB-8大孔吸附樹脂分別對(duì)未經(jīng)過(guò)萃取的MFE和經(jīng)過(guò)雙水相萃取后的萃取物進(jìn)行分離純化。將樣品配制成一定濃度的溶液，按5 mg總黃酮/g樹脂的上樣量上樣，保持3 mL/min的流速，用3倍柱體積（column volume，CV）的超純水沖洗，隨后用2 CV的10%乙醇水溶液除去雜質(zhì)，最后用3 CV的80%乙醇水溶液進(jìn)行洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮，凍干得到固體MLF1和MLF2。

1.3.7 桑葉黃酮的抗氧化活性測(cè)定

參考石玉平等[12]、陳青青等[13]、ALARA O R 等[14]、萬(wàn)聆[15]的方法，檢測(cè) MLF1 和 MLF2 對(duì)于·OH、ABTS+·、DPPH·、O2-·的清除能力，以蘆丁做陽(yáng)性對(duì)照，并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次平行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖表繪制使用Origin 2019b，采用IBM SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉黃酮分離萃取雙水相體系的確定

分相試驗(yàn)表明，氯化鈉無(wú)法與乙醇形成雙水相體系，其余無(wú)機(jī)鹽均可與乙醇形成雙水相溶液，結(jié)果如圖1所示。

圖1 4種不同無(wú)機(jī)鹽的雙水相系圖Fig.1 Aqueous two-phase systems with four different inorganic salt

由圖1可知，4種無(wú)機(jī)鹽分相范圍大小排序?yàn)榱蛩徜@>磷酸氫二鉀>碳酸鈉>硫酸鉀。乙醇-硫酸鉀體系中，硫酸鉀容易析出，分相時(shí)乙醇、無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較小，不利于黃酮類物質(zhì)的萃取。硫酸銨在乙醇中溶解度較低，與乙醇爭(zhēng)奪水分子能力較強(qiáng)，可達(dá)到很好的分離效果[16]。

此外，由于部分黃酮類化合物難溶于水，易溶于弱堿性溶液和乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑，而磷酸氫二鉀與碳酸鈉均為強(qiáng)堿弱酸鹽，溶液呈弱堿性，使得上下相黃酮幾乎平均分布，不利于黃酮類化合物在上相中富集[17-18]。因此，本研究選擇乙醇-硫酸銨雙水相體系進(jìn)行萃取分離，根據(jù)在雙水相系圖中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍25.80%～45.15%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍3.96%～20.38%，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2 雙水相體系單因素試驗(yàn)

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MFE添加量對(duì)桑葉黃酮萃取率Y的影響，結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖2 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate

圖3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate mass fraction on the extraction rate

圖4 MFE添加量對(duì)萃取率的影響Fig.4 Effect of the amount of MFE added on the extraction rate

由圖2可知，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，相比R逐漸增大，分配系數(shù)K先增大后減小。乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%～35%時(shí)，萃取率Y差異顯著（P<0.05），在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%時(shí)達(dá)到最大值，隨后略有減小，無(wú)顯著性差異?？赡苁怯捎谝掖紝?duì)水分子的競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)，使兩相更容易分開[19]，上相體積隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，而且黃酮具有醇溶性，這有助于黃酮類物質(zhì)在上相富集。然而，過(guò)高的乙醇濃度會(huì)導(dǎo)致鹽析出，還會(huì)引起小分子雜質(zhì)溶出，降低桑葉黃酮的溶解量[20]。因此，選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖3可知，相比R隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而減小，這是因?yàn)橄孪嘀辛蛩徜@結(jié)合水的能力增強(qiáng)，下相體積增加。分配系數(shù)K隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先上升后趨于平緩，萃取率Y隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先增大后略有減小。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～15%時(shí)，相比R、分配系數(shù)K和萃取率Y差異顯著（P<0.05）。硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，萃取率Y達(dá)到最大（95.61±0.97）%，此時(shí)下相溶液基本飽和，黃酮在上相中溶解較多，達(dá)到良好的分配效果。過(guò)飽和后會(huì)有硫酸銨析出，目標(biāo)物略有減少。因此，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

由圖4可知，隨著MFE添加量的增大，萃取率Y和分配系數(shù)K逐漸減小。相比R基本不變且無(wú)明顯差異。MFE添加量為2 mg/mL～6 mg/mL時(shí)，萃取率Y無(wú)顯著性差異。但當(dāng)MFE添加量≥8 mg/mL時(shí)，萃取率Y明顯下降，這是由于添加量過(guò)大，黃酮溶解度達(dá)到飽和。因此，為達(dá)到較高的萃取率并節(jié)約成本，選擇MFE添加量6 mg/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 雙水相體系響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

本試驗(yàn)采用擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以桑葉黃酮萃取率Y為響應(yīng)值，對(duì)乙醇-硫酸銨雙水相萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果和模型方差分析結(jié)果如表2和表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experimental results

表3 響應(yīng)面二次回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic regression model

由表3可知，模型的擬合度達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)不顯著，所選的二次回歸模型合理，能夠預(yù)測(cè)桑葉黃酮萃取率Y?；貧w模型R2=0.991 5，說(shuō)明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合情況良好。試驗(yàn)中3個(gè)因素對(duì)桑葉黃酮萃取率Y影響均為極顯著，影響大小依次為C>B>A，即MFE添加量>硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)>乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。響應(yīng)值與各因素間多元回歸擬合方程為Y=95.47+1.01A+1.30B-1.73C-0.70AB+0.42AC+0.14BC-1.62A2-1.30B2-1.91C2。

2.3.2 響應(yīng)面分析及驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面分析及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 各因素交互作用響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Surface plots and contour plots for the interactions of various factors

由圖5可知，交互項(xiàng)AB的等高線變化密集，變化范圍大，3D圖對(duì)角走勢(shì)陡峭，交互作用極顯著；交互項(xiàng)AC的等高線變化較密，變化范圍較大，3D圖對(duì)角走勢(shì)較陡，交互作用顯著；但交互項(xiàng)BC交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。研究表明，萃取率Y受3種因素綜合影響，不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出推薦工藝參數(shù)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)35.82%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)17.18%，MFE添加量5.16 mg/mL，預(yù)測(cè)萃取率Y為96.19%。為便于操作，選擇在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)17%、MFE添加量5 mg/mL的條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，桑葉黃酮萃取率Y 可達(dá)（95.74±0.58）%，此時(shí)相比 R=1.84±0.17，分配系數(shù)K=11.82±0.34，達(dá)到預(yù)測(cè)值的99.53%，說(shuō)明該試驗(yàn)選用的模型與實(shí)際擬合良好。

2.4 純化結(jié)果

經(jīng)過(guò)純化后，MLF1的純度達(dá)到（61.48±0.54）%，MLF2 純度達(dá)到（80.32±0.18）%，相較于蘇偉等[21]、王珂[22]單一大孔吸附法純化桑葉黃酮，純度提高了接近一倍。

2.5 桑葉黃酮抗氧化活性結(jié)果

2.5.1 ·OH清除率的測(cè)定

MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)·OH清除率的影響如圖6所示。

圖6 MLF1、MLF2、蘆丁對(duì)·OH清除率的影響Fig.6 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on·OH scavenging rate

由圖6可知，濃度為0.02 mg/mL～0.10 mg/mL時(shí)，MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)·OH清除率的影響隨樣品濃度增大而增大，存在劑量依賴效應(yīng)。根據(jù)半數(shù)抑制濃度比較，·OH清除能力從大到小依次為MLF2（IC50=0.028 mg/mL）>蘆?。↖C50=0.059 mg/mL）>MLF1（IC50=0.077 mg/mL），各組內(nèi)均存在顯著性差異。這是由于MLF2中存在多種黃酮類物質(zhì)，如蘆丁、槲皮素、桑色素、異槲皮苷、金絲桃苷等[23-25]，共同作用下對(duì)·OH清除能力優(yōu)于蘆丁單體。抗氧化活性與總黃酮純度存在正相關(guān)性[26]，而MLF1純度較低，清除能力較差。在0.10 mg/mL濃度下，MLF2對(duì)·OH清除率可達(dá)（87.18±1.00）%。

2.5.2 ABTS+·清除率的測(cè)定

MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)ABTS+·清除率的影響如圖7所示。

圖7 MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on ABTS+·scavenging rate

由圖7可知，在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)ABTS+·清除率的影響隨樣品濃度增加而增大，存在劑量依賴效應(yīng)。根據(jù)半數(shù)抑制濃度比較，ABTS+·的清除能力從大到小依次為蘆?。↖C50=0.033 mg/mL）>MLF2（IC50=0.034 mg/mL）>MLF1（IC50=0.064 mg/mL），MLF1清除率與其余兩組差異顯著。MLF2對(duì)于ABTS+·的清除能力相對(duì)較好。在0.10mg/mL濃度下，MLF2的ABTS+·清除率可達(dá)（99.70±0.31）%，與桑葉乙酸乙酯萃取物的結(jié)果基本一致[27]。這是因?yàn)镸LF2總黃酮純度較高，黃酮類化合物的B環(huán)3位酚羥基結(jié)構(gòu)可以有效增強(qiáng)抗氧化活性[28]。

2.5.3 DPPH·清除率的測(cè)定

MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)DPPH·清除率的影響如圖8所示。

圖8 MLF1、MLF2、蘆丁對(duì)DPPH·清除率的影響Fig.8 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on DPPH·scavenging rate

由圖8可知，在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)DPPH·清除率的影響隨樣品濃度增加而增加，存在劑量依賴效應(yīng)。隨著濃度的增加，MLF2的清除率逐漸高于MLF1和蘆丁。樣品濃度≥0.80 mg/mL時(shí)，MLF2清除率與其余兩組差異顯著，這是由于MLF2中多種黃酮的協(xié)同作用逐漸顯著[29]。根據(jù)半數(shù)抑制濃度比較，DPPH·的清除能力從大到小依次為 MLF2（IC50=0.066 mg/mL）>蘆丁（IC50=0.107mg/mL）>MLF1（IC50=0.112 mg/mL）。在 0.10mg/mL濃度下，MLF2的清除率可達(dá)（78.99±0.14）%，說(shuō)明雙水相萃取可顯著提升DPPH·清除能力。

2.5.4 O2-·清除率的測(cè)定

MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)于O2-·清除率的影響如圖9所示。

圖9 MLF1、MLF2、蘆丁對(duì)O2-·的清除率的影響Fig.9 Effects of MLF1，MLF2 and rutin on O2-·scavenging rate

由圖9可知，在0.02 mg/mL～0.10 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，MLF1、MLF2和蘆丁對(duì)O2-·清除率的影響隨樣品濃度增加而增加，存在劑量依賴效應(yīng)。根據(jù)半數(shù)抑制濃度比較，清除O2-·的能力從大到小依次為蘆?。↖C50=0.050 mg/mL）>MLF2（IC50=0.080 mg/mL）>MLF1（IC50=0.109mg/mL），各組內(nèi)均存在顯著性差異。MLF2對(duì)O2-·有一定的清除能力，相較于蘆丁略差，各濃度下均顯著低于蘆丁。0.10 mg/mL濃度下，MLF2的O2-·清除率可達(dá)（59.39±0.60）%。這可能是因?yàn)槌喾N黃酮的協(xié)同作用外，還可能因?yàn)榱u基數(shù)量較多，在特定反應(yīng)體系中分子間形成氫鍵，出現(xiàn)復(fù)雜的拮抗作用[29]，減弱了MLF2對(duì)于O2-·的清除能力。

3 討論與結(jié)論

本研究旨在選擇綠色安全、便于量產(chǎn)的純化方法，得到較高純度的桑葉黃酮，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，雙水相萃取系統(tǒng)的最佳工藝參數(shù)為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)36%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)17%、MFE添加量5 mg/mL，進(jìn)一步純化后得到MLF2，其純度達(dá)到（80.32±0.18）%。此外，MLF2抗氧化能力顯著高于MLF1，初步證明經(jīng)雙水相萃取得到的桑葉黃酮具有良好的抗氧化活性，說(shuō)明在純化過(guò)程中有效去除了很多對(duì)反應(yīng)體系產(chǎn)生影響的雜質(zhì)。上述試驗(yàn)結(jié)果可為桑葉黃酮的分離純化以及活性研究提供參考，具有一定的理論研究及工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。