劉文超, 田 禾, 程 娜, 薛麗燕, 馮小龍, 鄭 波

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院國家癌癥中心/國家癌癥臨床研究中心/北京腫瘤醫(yī)院1. 病理科, 2. 胸外科, 北京, 100021)

目前，肺癌在所有惡性腫瘤中死亡率最高[1-2]。病理診斷醫(yī)師在蘇木精-伊紅(HE)染色中不易判斷腫瘤細胞是否侵犯臟層胸膜時，需加行彈力纖維染色。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南TNM分期標準，即使腫瘤直徑≤3 cm, 只要侵犯臟層胸膜，應(yīng)歸為T2期，而非T1期，故彈力纖維染色對肺癌患者的準確臨床分期具有重要意義。胸膜侵犯程度與肺癌腫瘤 TNM 分期具有良好的相關(guān)性，是影響肺癌患者術(shù)后預后的重要危險因素[3]。由于不健康的生活方式和遺傳背景，年輕人結(jié)直腸癌(CRC)的發(fā)病率逐年上升[4]。彈力纖維染色可有效提高結(jié)直腸癌臟層腹膜彈力層侵犯(VPELI)和血管侵犯(VI)的檢出率。VPELI陽性腫瘤患者提示預后不良[5]。癌癥的發(fā)病率逐漸升高，正確判斷腫瘤是否侵犯及侵犯程度尤為重要。在臨床病理工作中存在多種效果各異的彈力纖維染色方法，但對不同方法之間差異的研究較少。本研究通過對Victoria blue 法和Verhoeff法這2種染色方法的染色過程、染色時間、染色效果及對肺癌胸膜、結(jié)直腸癌漿膜或靜脈侵犯判讀難易進行對比，找到了一種操作簡單、染色穩(wěn)定、容易判讀的彈力纖維染色方法。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年9—12月懷疑侵犯的肺癌標本50例、結(jié)直腸標本20例為研究對象。每例病例切2張白片，分別入組Victoria blue 法(A組)和Verhoeff法(B組)。所有病例均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定液固定后石蠟包埋切片。

1.2 試劑

1.2.1 A組所用試劑: ①維多利亞藍染色液[6]。維多利亞藍2.0 g, 糊精0.5g,間苯二酚4.0 g, 蒸餾水200.0 mL。將上述物質(zhì)混合后加熱煮沸，邊煮邊攪拌，約5 min。然后用另一容器取30.0%的三氯化鐵水溶液25.0 mL, 另行加熱煮沸后慢慢倒入上述混合液中，繼續(xù)煮沸3 min, 不斷攪拌溶液呈膠體狀。去火冷卻過濾，將濾紙上的殘渣連同濾紙一同放在60 ℃的恒溫箱中烤干。殘渣呈深藍色細顆粒狀粉末，再將其溶于400.0 mL的70.0%乙醇液中，然后加濃鹽酸4.0 mL和苯酚5.0 g, 放置至成熟后使用。② 核固紅染色液。核固紅0.1 g, 硫酸鋁5.0 g, 蒸餾水100.0 mL, 麝香草酚50.0 mg。先將硫酸鋁溶于蒸餾水，然后加入核固紅，稍微加溫溶解，冷卻后過濾，加入麝香草酚。

1.2.2 B組所用試劑: ① 鐵碘蘇木素溶液(彈性纖維染色液-Ⅰ)。蘇木素2.8%, 三氯化鐵5.0%, Verhoeff氏碘液(碘化鉀2.0 g、典結(jié)晶1.0 g、實驗室三級水100.0 mL), 無水乙醇。② 三氯化鐵溶液(彈性纖維染色液-Ⅱ)。三氯化鐵2.0%, 實驗室三級水。VG染色液(彈性纖維染色液-Ⅲ)。酸性復紅液1.5%, 桔黃G 0.5%, 實驗室三級水。

1.3 染色方法

1.3.1 彈力纖維染色: 2位技師對入組標本隨機平均分配(每位技師25例肺癌及10例結(jié)直腸癌)，進行A組和B組彈力纖維染色。染色方法如下: ⑴ A組。① 石蠟切片，脫蠟入水。② 切片入70.0 %乙醇1 min。③ 切片浸入Victoria blue 染液中1.5 h。④ 用95.0%乙醇分化2～3 s, 水洗。⑤ 切片浸入核固紅染液8～15 min, 水洗。⑥ 用95.0%乙醇及無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。⑵ B組。① 切片脫蠟至水。② 鐵碘蘇木素染色15～30 min, 至顏色呈深黑色。自來水洗。③ 三氯化鐵溶液分化10～20 s, 至彈力纖維清晰為止，自來水充分水洗。④ 入95.0%乙醇2～5 min, 自來水水洗2遍。⑤ 滴染VG染色液染色1～2 min。⑥ 用95.0%乙醇急速分化。無水乙醇脫水，二甲苯透明、中性樹膠封固。

1.3.2 2種染色方法的比較: 對2種方法的染色過程、操作時間進行對比。染色判讀及評分: 請2位病理醫(yī)師盲法對所有特染切片染色效果、腫瘤侵犯判讀難易程度進行評價，對胸膜、漿膜或靜脈侵犯結(jié)果進行判讀。評分標準: 從彈力纖維定位定性準確、染色背景干凈、腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰、炭末有無影響炭判讀這4個方面進行判讀評價，單項分數(shù)最高2分，最低0分，即彈力纖維定性定位不準確0分，較準確1分，準確2分; 染色背景不干凈0分，較干凈1分，干凈2分; 腫瘤與彈力纖維對比不清晰0分，較清晰1分，清晰2分; 炭末有影響0分，較影響1分，無影響2分。4項內(nèi)容滿分共計8分。

1.4 統(tǒng)計學分析

評分匯總應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用兩配對樣本的Wilcoxon非參數(shù)檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種染色方法染色步驟及染色時間比較

分化是染色程序的關(guān)鍵步驟, A組和B組分別耗時2～3 s和35 min。見表1。

表1 2種方法染色過程、操作時間對比

2.2 判讀結(jié)果

2種方法的判讀結(jié)果顯示，A組分別有41.43%、58.57%的患者被判讀為侵犯性和無侵犯性，所有患者均可通過Victoria blue法判讀。B組分別有37.14%、61.34%的患者被判讀為侵犯性和無侵犯性, 1例患者不能通過Verhoeff法判讀。見表2。

表2 肺癌胸膜侵犯、結(jié)直腸癌漿膜或靜脈侵犯判讀結(jié)果比較[n(%)]

2.3 染色評分

A組各項評分均高于B組，且A組總分[(7.42±0.94)分]高于B組總分[(4.89±1.53)分]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 彈力纖維染色評分 分

2.4 染色效果

A組分化易掌握，腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰，炭末不影響判讀，低倍鏡下易判讀。B組分化不易掌握，腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰，炭末影響判讀，低倍鏡下不易判讀。見圖1。

3 討 論

目前公認臟層胸膜由以下 4層構(gòu)成: 間皮細胞層; 間皮下結(jié)締組織層; 彈力纖維層; 結(jié)締組織層分隔彈力纖維和肺實質(zhì)[7]。彈力纖維染色在肺癌病例中主要用于顯示腫瘤細胞與胸膜的關(guān)系，從而評估腫瘤侵犯層次，對病理學指標的TNM分期有重要臨床意義。在結(jié)直腸癌中，漿膜或靜脈侵犯是評價臨床術(shù)后病理分期(pTNM)及臨床個體化治療的重要指標[8-9]。

高效準確的病理報告對臨床醫(yī)生進行臨床決策至關(guān)重要。在實際的臨床工作中，病理醫(yī)生的工作量大。操作簡單、染色穩(wěn)定、容易判讀的彈力纖維染色方法對病理技術(shù)人員和病理醫(yī)師具有重要意義。肺癌胸膜侵犯、結(jié)直腸癌漿膜或靜脈侵犯判讀結(jié)果(表2)表明，A組和B組相比，B組存在漏診，導致漏診病例的TNM分期不準確，進而對判斷患者預后及后期個體化治療造成影響。

B組存在漏診的原因主要有以下幾個方面: 首先, B組彈力纖維呈黑色，細胞核呈棕黑色、膠原纖維呈紅色。細胞核和彈力纖維對比不明顯，難以辨認二者之間的關(guān)系(圖1b)。在低倍鏡下，醫(yī)生很難通過B組染色分辨肺癌胸膜是否侵犯、結(jié)直腸癌漿膜或靜脈是否侵犯(圖1b、2b)。而A組彈力纖維呈藍色，細胞核呈紅色。該法在染液中浸染1.5 h, 用核固紅復染，紅色的細胞核與藍色的彈力纖維對比清晰，對較粗、較細的彈力纖維染色效果均顯著[10], 能夠清晰顯示腫瘤細胞與彈力纖維的關(guān)系(圖1a), 通過該法醫(yī)生在低倍鏡下能輕松、準確判讀肺癌胸膜、結(jié)直腸癌漿膜或靜脈是否侵犯(圖1a、2a), 從而提高診斷工作效率。其次，在肺癌病例中, B組炭末、細胞核及彈力纖維均為黑色，黑色的炭末影響細胞核與彈力纖維關(guān)系的判讀(圖3b)。而A組彈力纖維呈藍色，細胞核呈紅色，黑色的炭末不影響細胞核與彈力纖維關(guān)系的判讀(圖3a), 細胞核與彈力纖維對比清晰(圖4a、5a), 染色效果能夠滿足病理醫(yī)生的診斷需求。再次，B組對三氯化鐵分化步驟要求較高，需根據(jù)彈力纖維清晰程度決定分化時間，因此需要進行單張分化。根據(jù)實驗結(jié)果(表1)，如同時染多張切片，染色技術(shù)員需付出較長時間進行該染色方法的分化工作，且容易出現(xiàn)分化不一致、染色結(jié)果不穩(wěn)定的情況。當分化不夠時，染色結(jié)果對比不清晰(圖4b); 分化過度時，則不能較好地顯示彈力纖維(圖5b), 容易出現(xiàn)因分化不佳導致的重復染色，從而影響診斷。此外，該法染液不能長期保存和重復使用。而A組分化過程不用單張操作，分化時間短且一致，工作效率提高，降低了技術(shù)人員的工作難度，提高了染色穩(wěn)定性。此外該法染液適宜浸染，配置結(jié)束后約0.5 h放置成熟即可使用，常溫條件下可保存數(shù)年，使用方便。

1a: A組染色效果。肺癌,腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰; 1b: B組染色效果。肺癌,腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰; 2a: A組染色效果。腸癌,低倍鏡下易判讀; 2b: B組染色效果。腸癌,低倍鏡下不易判讀; 3a: A組染色效果。肺癌,炭末不影響判讀; 3b: B組染色效果。肺癌,炭末影響判讀; 4a: A組染色效果。肺癌,分化易掌握,腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰; 4b: B組染色效果。肺癌,分化不夠,腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰; 5a: A組染色效果。肺癌,分化易掌握,腫瘤細胞與彈力纖維對比清晰; 5b: B組染色效果。肺癌,分化過度,腫瘤細胞與彈力纖維對比不清晰。圖1 2種彈力纖維染色方法的染色效果(放大倍數(shù)10倍)

綜上所述, Victoria blue法染色對肺癌臟層胸膜侵犯和結(jié)直腸癌漿膜或靜脈侵犯結(jié)果的判讀更清晰、準確，能很好地滿足病理醫(yī)生診斷的需要，具有染色質(zhì)量穩(wěn)定、對比清晰、炭末不影響判讀、操作簡單和安全可靠等諸多優(yōu)點，能夠為病理診斷提供更加可靠的依據(jù)，為腫瘤患者提供更高效的服務(wù)。