陳 莉, 李青山, 張學(xué)強(qiáng), 任利彬, 索曉慧, 張叢叢

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院, 1. 血液內(nèi)一科, 2. 骨科, 3. 口腔頜面外科, 4. 普外科, 河北 邯鄲, 056001)

髓系白血病(ML)是一種具有表型和遺傳異質(zhì)性的惡性血液病[1]。ML是白血病中最常見的類型，病死率高，醫(yī)療費(fèi)用高，給患者及其家屬帶來較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。盡管化療聯(lián)合干細(xì)胞移植已被證明可有效治療ML, 但最常見的死亡原因是骨髓衰竭，只有30%～40%的年輕患者和不到20%的老年患者可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期生存[3]。相關(guān)研究[4]顯示, ML的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因啟動(dòng)子高甲基化密切相關(guān)。因此，降低抑癌基因高甲基化狀態(tài)或可成為治療ML的一種新策略。細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1(SOCS-1)是一種腫瘤抑制因子，在肝癌和急性髓系白血病(AML)中都發(fā)現(xiàn)了該基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA高甲基化而導(dǎo)致SOCS-1沉默的現(xiàn)象[5]。但SOCS-1基因啟動(dòng)子去甲基化對(duì)ML細(xì)胞增殖、凋亡的影響尚不完全清楚。本研究利用地西他濱(DCA)構(gòu)建SOCS-1去甲基化的U937細(xì)胞系，研究SOCS-1去甲基化對(duì)U937細(xì)胞增殖、凋亡的影響，旨在為ML的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 ML骨髓標(biāo)本和細(xì)胞系

選取2018年3月—2020年3月在邯鄲市中心醫(yī)院收集的78例ML患者的骨髓標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，另外收集50例健康捐獻(xiàn)者的骨髓標(biāo)本作為對(duì)照組，所有ML患者均為首次在邯鄲市中心醫(yī)院確診為ML, 且未接受任何治療。該研究得到邯鄲市中心醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情并自愿簽署知情同意書。人ML細(xì)胞系U937、HL-60、K562和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶購自上海雅吉生物科技有限公司; 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培養(yǎng)基、BCA試劑盒均購自美國Bio-Rad公司; TransStart?Green qPCR SuperMix購自TaKaRa公司; 總蛋白提取試劑盒購自艾美捷科技有限公司; Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; CCK-8試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司; SOCS-1、β-actin兔多克隆抗體(anti-SOCS-1、anti-β-actin)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司; 熒光定量PCR儀購自美國ABI公司, CO2培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

采用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人ML細(xì)胞系U937、HL-60、K562和人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5, 所有細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U937細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL, 接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，參照文獻(xiàn)[6]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果用0、0.8、1.6、3.2 μmol/L DCA分別處理U937細(xì)胞，并分別命名為空白組、DCA-L組(DCA低劑量)、DCA-M組(DCA中劑量)、DCA-H組(DCA高劑量)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.4 甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MS-PCR)檢測(cè)SOCS-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

采用苯酚氯仿法抽提ML骨髓標(biāo)本和各組U937細(xì)胞的DNA, 紫外分光光度計(jì)用于檢測(cè)DNA的純度。將4 μL DNA與40 μL去離子水混合，加入10 μL 氫氧化鈉(NaOH)溶液(3 mol/L)于37 ℃下孵育20 min, 再加入30 μL對(duì)苯二酚(10 mmol/L)與520 μL亞硫酸氫鈉(1.5 mol/L)于50 ℃下孵育16 h。利用DNA純化試劑盒回收DNA, 最后再加入50 μL NaOH溶液(1 mol/L), 室溫靜置5 min以終止修飾，利用無水乙醇沉淀DNA, 經(jīng)離心干燥后，加入15 μL去離子水保存于-20 ℃環(huán)境中。亞硫酸氫鈉處理的DNA用甲基化特異性或非甲基化特異性引物擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性10 min; 95 ℃ 20 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán); 72 ℃ 10 min進(jìn)行最后的延伸步驟。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠染色并在紫外線照射下觀察目的條帶。判斷甲基化標(biāo)準(zhǔn): ① 完全甲基化，甲基化引物擴(kuò)增出現(xiàn)陽性條帶，非甲基化引物未擴(kuò)增出條帶; ② 部分甲基化，甲基化引物、非甲基化引物均擴(kuò)增出陽性條帶; ③ 非甲基化，甲基化引物未擴(kuò)增出現(xiàn)陽性條帶，非甲基化引物擴(kuò)增出陽性條帶。完全甲基化、部分甲基化均為甲基化陽性。所用引物序列見表1。

表1 SOCS-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化引物(SOCS-1 M)與非甲基化引物(SOCS-1 U)

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)SOCS-1 mRNA表達(dá)水平

Trizol試劑用于從ML患者骨髓及ML細(xì)胞中分離總RNA。利用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用TransStart?Green qPCR SuperMix在熒光定量PCR儀上對(duì)SOCS-1進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，通過2-△△CT方法計(jì)算SOCS-1mRNA相對(duì)表達(dá)水平。所用引物序列為:SOCS-1正向5′-TGCGCCTCAAGACCTTCAG-3′, 反向5′-CATCAGGCTCTCGCTTTTGGA-3′;GAPDH正向5′-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3′, 反向5′-GGTGGAATCATATTGGAACA-3′。

1.6 Western blot檢測(cè)SOCS-1蛋白表達(dá)水平

利用總蛋白提取試劑盒提取ML患者骨髓及各組細(xì)胞的總蛋白。使用BCA試劑盒測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。利用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離40 μg蛋白質(zhì)，并電印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用5%脫脂牛奶封閉膜，再加入一抗anti-SOCS-1(1∶2 000)、anti-β-actin(1∶3 000)于4 ℃下孵育過夜，第2天將膜用洗膜緩沖液(TBST)洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，于37 ℃下孵育1 h, 使用ECL發(fā)光試劑盒觀察蛋白質(zhì)的顯色情況，以β-actin為內(nèi)參，利用Image J分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.7 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

將各組細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種到96孔板中。在DCA處理24、48、72 h時(shí)，分別向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8試劑，在37 ℃下孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處光密度值(OD450 nm)。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

將各組細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的密度接種到6孔板中，在DCA處理48 h后收集各組細(xì)胞。在室溫下將各組細(xì)胞與膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙啶染色試劑避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 SOCS-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

50例對(duì)照標(biāo)本中,SOCS-1基因啟動(dòng)子甲基化陽性率為0%, 78例ML患者標(biāo)本中SOCS-1基因啟動(dòng)子甲基化陽性率為83.33%, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白在ML患者及細(xì)胞系中的表達(dá)水平

SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1、表2。人ML細(xì)胞系U937、HL-60、K562中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)低于人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5，且U937細(xì)胞中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)水平最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，以U937細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2、表3。

圖1 Western blot檢測(cè)SOCS-1蛋白表達(dá)

表2 SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白在ML患者和健康者中的表達(dá)水平

A: HS-5細(xì)胞; B: U937細(xì)胞; C: HL-60細(xì)胞; D: K562細(xì)胞。圖2 Western blot檢測(cè)ML細(xì)胞系中SOCS-1蛋白表達(dá)

表3 SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白在ML細(xì)胞系中的表達(dá)水平

2.3 DCA對(duì)U937細(xì)胞SOCS-1甲基化狀態(tài)及SOCS-1表達(dá)的影響

MS-PCR結(jié)果顯示,SOCS-1在空白組U937細(xì)胞中呈高甲基化狀態(tài)，經(jīng)不同濃度的DCA處理后,SOCS-1的甲基化水平降低，且DCA濃度越高,SOCS-1的甲基化水平越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明，與空白組比較, DCA-L組、DCA-M組、DCA-H組中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)升高，且DCA濃度越高,SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)水平越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4、表4。

A: 空白組; B: DCA-L組; C: DCA-M組; D: DCA-H組。圖3 MS-PCR檢測(cè)DCA對(duì)U937細(xì)胞SOCS-1甲基化狀態(tài)的影響

A: 空白組; B: DCA-L組; C: DCA-M組; D: DCA-H組。圖4 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中SOCS-1蛋白表達(dá)

表4 DCA對(duì)U937細(xì)胞中SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)的影響

2.4 各組細(xì)胞增殖能力比較

與空白組比較, DCA-L組、DCA-M組、DCA-H組U937細(xì)胞OD450 nm值(24、48、72 h)降低，且DCA濃度越高, U937細(xì)胞OD450 nm值(24、48、72 h)越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

與空白組比較, DCA-L組、DCA-M組、DCA-H組U937細(xì)胞凋亡率升高，且隨著DCA濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖5、表6。

表5 各組細(xì)胞OD450 nm值(24、48、72 h)比較

A: 空白組; B: DCA-L組; C: DCA-M組; D: DCA-H組。圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

3 討 論

ML是一種造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，其特征是未成熟髓系祖細(xì)胞的增殖失控和凋亡受阻[7]。相關(guān)研究[8]表明，遺傳異常和表觀遺傳改變?cè)贛L的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。DNA甲基化異常是ML中最常見的表觀遺傳變化，該過程未涉及DNA序列改變，主要是通過在轉(zhuǎn)錄前對(duì)染色體進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，從而影響基因功能[6]。研究[9]證明, DNA低甲基化和高甲基化在腫瘤發(fā)展中經(jīng)常發(fā)生; 基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的高甲基化通常與腫瘤抑制基因的失活有關(guān)[10]; 在造血系統(tǒng)疾病中，異常的DNA高甲基化被證明與白血病的發(fā)生有關(guān)[11]。而作為DNA甲基化的關(guān)鍵效應(yīng)物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT), 其具有催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶5′位上，在DNA甲基化的發(fā)生中具有重要作用[12]。因此，從抑制DNMT的角度出發(fā)，來減弱DNA甲基化成為近年來研究治療ML的熱門話題。

表6 各組細(xì)胞凋亡率比較

SOCS-1是位于染色體16p13.3上的可編碼211個(gè)氨基酸的基因，其能通過直接與Janus激酶相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。據(jù)研究[14]報(bào)告，由于啟動(dòng)子甲基化，SOCS-1在許多癌癥中呈低表達(dá)狀態(tài);SOCS-1基因在成人AML中甲基化水平明顯增高，且SOCS-1基因甲基化后其mRNA表達(dá)水平受到抑制[15];SOCS-1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。本研究結(jié)果表明, ML患者標(biāo)本中SOCS-1基因啟動(dòng)子甲基化陽性率為83.33%, 顯著高于健康對(duì)照組，且ML患者標(biāo)本中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示SOCS-1在ML中呈高甲基化狀態(tài)，且SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)受到抑制; 本研究還通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)人ML細(xì)胞系U937、HL-60、K562中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)顯著低于人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5, 且U937細(xì)胞中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表達(dá)水平最低，因此以U937細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

DCA是一種新型表觀遺傳藥物，在體內(nèi)磷酸化后進(jìn)入DNA，通過抑制DNMT的活性，誘導(dǎo)DNA去甲基化，從而激活因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化而沉默抑癌基因的表達(dá)[17]。相關(guān)研究[18]證實(shí), DCA適用于不適合高劑量治療的老年人和移植患者，已成為老年AML患者的一線治療藥物; 體外應(yīng)用DCA有助于抑制hPer3基因甲基化，進(jìn)而誘導(dǎo)hPer3基因表達(dá)和促進(jìn)AML細(xì)胞凋亡[19]; DCA可抑制SHP-1基因甲基化，進(jìn)而抑制骨髓增生異常綜合征細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡[20]。為了進(jìn)一步研究SOCS-1去甲基化對(duì)U937細(xì)胞增殖、凋亡的影響，本研究利用0.8、1.6、3.2 μmol/L DCA構(gòu)建SOCS-1去甲基化的U937細(xì)胞系，結(jié)果表明SOCS-1在空白組U937細(xì)胞中呈高甲基化狀態(tài)，經(jīng)不同濃度的DCA處理后,SOCS-1的甲基化水平顯著降低，且DCA濃度越高，SOCS-1的甲基化水平越低，提示SOCS-1去甲基化的U937細(xì)胞系構(gòu)建成功。此外，經(jīng)DCA處理后, U937細(xì)胞的增殖能力降低，凋亡能力增強(qiáng)，且DCA濃度越高，這種趨勢(shì)越顯著，提示SOCS-1去甲基化可抑制U937細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與張曉慧等[21]研究結(jié)果相一致，其研究表明在AML中通過將DNMT基因敲除可將SOCS-1基因去甲基化，上調(diào)SOCS-1基因表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述,SOCS-1去甲基化可抑制U937細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此，從降低SOCS-1甲基化角度來研究治療ML可能成為一個(gè)新的策略。