黃 蓉, 樊 斌, 丁 俊

(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院 肝膽胰脾外科, 湖北 恩施, 445000)

肝細胞癌(HCC)占所有肝癌病例的70%～85%, 是導致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。目前，手術(shù)切除仍是治愈HCC的主要手段，但約80%的HCC患者在根治性切除術(shù)后仍會發(fā)生肝內(nèi)復發(fā), 5年病死率超過50%[2]。原發(fā)性HCC復發(fā)包括肝內(nèi)復發(fā)和多中心復發(fā)，肝內(nèi)復發(fā)主要與腫瘤因素有關(guān)，而多中心復發(fā)還可能與其他肝臟背景因素有關(guān)[3-4]。因此，僅關(guān)注腫瘤組織是不夠的，癌旁組織有關(guān)分子學改變也可能會直接或間接影響手術(shù)后疾病進展。簇集蛋白(CLU)是最初從大鼠睪丸中分離出的一種高度保守的糖蛋白，在人體所有組織中都有表達[5]。事實上,CLU基因可編碼分泌型sCLU蛋白(sCLU)和核sCLU蛋白(nCLU), 而sCLU和nCLU蛋白在腫瘤發(fā)生和發(fā)展的各個病理生理過程中可能發(fā)揮著相反的作用[6-7]。多項研究[6-9]證實了sCLU在各種惡性腫瘤中的預后價值，但結(jié)果卻相互矛盾。本研究調(diào)查sCLU在可切除HCC患者癌旁肝組織和血清中的表達水平及預后評估作用，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究是在獲得本院機構(gòu)審查委員會的批準并在赫爾辛基宣言指導原則下進行的?；颊咴跇颖精@取前簽署了知情同意書，所有患者數(shù)據(jù)都是匿名的。選取2010年1月—2015年12月在本院肝膽胰脾外科接受治愈性肝切除術(shù)的208例HCC患者為研究對象，均獲得血清樣本、切除的腫瘤組織和癌旁肝組織樣本。排除接受過任何術(shù)前治療(如化療、乙醇注射或經(jīng)動脈化療栓塞)的患者。經(jīng)術(shù)后病理組織學檢查證實了原發(fā)性HCC診斷。根治性切除定義為宏觀上完全切除腫瘤，組織學檢查陰性。208例患者的平均年齡為(59.0±13.56)歲，其中男162例(77.88%); 126例(60.58%)為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性, 63例(30.29%)為抗丙型肝炎病毒(HCV)陽性, 31例(14.90%)有HCC家族史; 中位腫瘤直徑為5.0 cm[四分位距(IQR)為3.5～12.0 cm]; 病理檢查證實微血管侵犯105例(50.48%); 根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際癌癥控制聯(lián)盟(UICC)第7版腫瘤、淋巴結(jié)和轉(zhuǎn)移(TNM)分期系統(tǒng)[10]對HCC組織進行分類, Ⅰ期54例, Ⅱ期84例, Ⅲ期70例; 84例(40.38%)為肝硬化。因此，大部分患者被診斷為慢性肝病、肝功能異常，平均吲哚菁綠15 min滯留率(ICG-R15)為(14.5±10.8)%(正常為0%～10%)。

1.2 樣本獲取和臨床資料收集

所有患者在手術(shù)前禁食≥10 h后采集血液樣本，立即分離血清并存儲于-80 ℃環(huán)境中。每個樣本只經(jīng)歷1次凍融。此外，手術(shù)切除后立即獲得組織標本，在液氮中迅速冷凍, 24 h后轉(zhuǎn)移至-70 ℃環(huán)境中保存。前瞻性獲取術(shù)前臨床和實驗室數(shù)據(jù)、切除標本的組織學分析以及術(shù)后生存數(shù)據(jù)。詳細的臨床病理特征包括常規(guī)肝臟生化指標、肝炎標志物、血清甲胎蛋白(AFP)水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量和血管浸潤?；谔K木精-伊紅染色(HE染色)切片檢查進行組織學評估。分析HCC標本、血清中凝聚素表達與重要的臨床病理參數(shù)的關(guān)系，包括年齡、性別、抗HCV狀態(tài)、HBsAg狀態(tài)、血清AFP水平、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、ICG-R15水平、血清白蛋白水平、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平、宏觀/微觀血管浸潤和肝硬化。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清中sCLU水平

采用ELISA試劑盒(捷克BioVendor Laboratory Medicine Inc公司)測定血清sCLU水平。所有樣品和標準品以一式兩份進行評估，并計算平均值。首先將稀釋后的樣品和標準品用移液管移入96孔板中，室溫下孵育2 h后洗滌平板，采用sCLU偶聯(lián)物孵育2 h; 然后加入底物溶液并在室溫下孵育30 min, 加入終止液終止反應，在450 nm處通過Spectra Max 250酶標儀(美國Molecular Devices. 公司)讀板。sCLU濃度以μg/mL表示，并通過與參考標準進行比較來評估。

1.4 免疫組化法檢測組織sCLU蛋白表達

將組織標本在4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜，并使用自動包埋機包埋在蠟中。此外，樣品通過一系列乙醇梯度脫水(70%、80%、90%、100%)后經(jīng)氯仿清洗，然后包埋在石蠟中。將再水化的組織切片用檸檬酸鈉緩沖液(10 mmol/L, pH值6.0)微波處理，用3.0% H2O2孵育10 min，封閉液浸泡10 min。將組織切片與sCLU單克隆抗體(克隆B-5, 1∶200稀釋; 美國Santa Cruz Biotechnology公司)在4 ℃的濕室中孵育過夜。此外，將組織切片載玻片用生物素標記的二抗孵育10 min, 然后用鏈霉親和素辣根過氧化物酶結(jié)合物再處理10 min, 3, 3′-二氨基聯(lián)苯胺底物顯色10 min, Mayer′s蘇木精復染10 min。將載玻片安裝在顯微鏡下評估。采用PBS替代一抗作為陰性對照。評估標準[11]: 陰性(-)為弱染色或未染色, (+)為<10%的腫瘤細胞中觀察到陽性表達，陽性表達≥10%的腫瘤細胞為中度染色()至強染色()。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 血清sCLU水平與術(shù)后生存率的關(guān)系

208例HCC患者隨訪時間為2～130個月，中位隨訪時間為58個月; 復發(fā)142例(68.27%), 復發(fā)時間為38.0個月; 隨訪期間死亡112例(53.85%)。所有患者術(shù)前血清sCLU水平為89.11(63.23, 119.47) μg/mL, 且血清sCLU水平與腫瘤分期無相關(guān)性; 單因素分析顯示，術(shù)前高sCLU水平(≥89.11 μg/mL,n=104)與低sCLU水平(<89.11 μg/mL,n=104)患者的生存期比較，差異無統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2=1.815,P=0.178)。見圖1。

A: 不同TNM分期患者血清sCLU水平比較; B: Kaplan-Meier生存曲線。

2.2 HCC和癌旁肝組織中sCLU的免疫組化染色結(jié)果

在115例(55.29%)腫瘤組織和81例(38.94%)癌旁肝組織中檢測到sCLU蛋白陽性表達，見圖2。

A: 腫瘤組織,陰性; B: 腫瘤組織,陽性; C: 配對的癌旁肝組織,陰性; D: 配對的癌旁肝組織,陽性。圖2 免疫組化法檢測HCC腫瘤組織和癌旁肝組織中sCLU蛋白表達

2.3 HCC和癌旁肝組織中sCLU的免疫組化染色結(jié)果與術(shù)后生存率的關(guān)系

腫瘤組織中sCLU蛋白表達陽性與陰性患者的無病生存率差異無統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2=1.763,P=0.184); 癌旁肝組織中sCLU表達陽性的患者的術(shù)后無病生存率低于sCLU表達陰性的患者，差異有統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2=9.853,P=0.002)。見圖3。生存分析結(jié)果顯示，癌旁肝組織sCLU蛋白表達與腫瘤組織sCLU蛋白表達呈顯著正相關(guān)性(rs=0.679,P<0.001)。此外，癌旁肝組織sCLU陽性表達者的腫瘤復發(fā)率為81.48%(66/81), 高于陰性表達者的59.84%(76/127), 差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.691,P=0.001)。HCC組織中sCLU陽性表達者的腫瘤復發(fā)率為71.30%(82/115), 陰性表達者為64.52%(60/93), 差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.094,P=0.296)。

A: 腫瘤組織sCLU蛋白表達; B: 癌旁肝組織sCLU蛋白表達。

2.4 肝組織中sCLU蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

腫瘤組織及癌旁肝組織中, sCLU蛋白陽性表達者血清sCLU水平均高于陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此外，腫瘤組織sCLU蛋白表達與TNM分期有關(guān)(P=0.008), 而癌旁肝組織sCLU蛋白表達與其他臨床病理特征無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 肝組織sCLU蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 影響HCC患者術(shù)后復發(fā)的臨床因素

單因素分析顯示，血清AFP>200 ng/mL、血清白蛋白≤4.0 g/dL、多發(fā)腫瘤、腫瘤直徑>5 cm、微血管浸潤、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織中sCLU蛋白陽性表達是影響HCC患者術(shù)后復發(fā)的獨立危險因素(P<0.001)。見表2。

表2 Kaplan-Meier法對術(shù)后復發(fā)的單因素生存分析[n(%)]

2.6 多因素Cox比例風險模型分析

將重要的協(xié)變量從單變量分析進入多因素Cox比例風險模型。結(jié)果顯示，血清AFP>200 ng/mL、血清白蛋白≤4.0 g/dL、微血管浸潤、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織sCLU蛋白陽性表達是HCC患者術(shù)后無病生存的獨立危險因素(P<0.05)。此外，多發(fā)腫瘤、微血管浸潤、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期以及癌旁肝組織sCLU蛋白陽性表達亦是影響HCC患者術(shù)后總生存的獨立危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 無病生存和總生存相關(guān)因素的多因素分析結(jié)果

3 討 論

本研究評估了HCC患者在腫瘤切除前的血清和切除組織(包括肝癌組織以及鄰近的癌旁肝組織)中sCLU濃度。本研究結(jié)果表明，術(shù)前血清sCLU水平、HCC腫瘤組織中sCLU蛋白表達情況與可切除HCC患者術(shù)后復發(fā)無相關(guān)性。有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)癌旁肝組織中sCLU蛋白陽性表達者較陰性表達者的預后更差。

研究[5]表明, sCLU與腫瘤集落蛋白的特性和腫瘤癌細胞的化學耐藥性相關(guān)[9, 12]。sCLU基因是一個單拷貝基因，位于染色體8p21～p12上，由9個外顯子、8個內(nèi)含子和1個5′-非翻譯區(qū)組成，編碼3種不同的人類轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。在人體中,sCLU基因可編碼2種蛋白質(zhì): sCLU蛋白(75～80 kDa)和nCLU蛋白(55 kDa)[6]。sCLU蛋白的前22個氨基酸代表一個經(jīng)典的疏水性先導信號序列，這些氨基酸被轉(zhuǎn)化成一個先導多肽，將蛋白質(zhì)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 22肽通過蛋白水解過程被去除，產(chǎn)生一個50 kDa的前體，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進一步加工成60 kDa的形式。當?shù)鞍踪|(zhì)被轉(zhuǎn)運到高爾基復合體時，即被糖基化，進一步分裂成2個40 kDa亞基，α 鏈和 β 鏈。然后，這2個亞基組裝成異二聚體絡合物，由5個二硫鍵連接。nCLU是由缺乏外顯子II剪接的mRNA合成的。第一和第三外顯子是拼接在一起的，放置第二幀外顯子III的第2個AUG序列作為翻譯起始位點。nCLUmRNA的翻譯產(chǎn)生了一種約49 kDa 的nCLU前體蛋白，定位于細胞質(zhì)中，并保持休眠狀態(tài)。在全身電離輻射或細胞損傷后, nCLU前體蛋白經(jīng)過翻譯后修飾產(chǎn)生1個成熟的約55 kDa促凋亡蛋白形式，其具有N端和C端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。研究[7, 14]表明, sCLU具有細胞保護作用和抗凋亡作用[6, 13], 而 nCLU蛋白具有促凋亡作用。

sCLU是一種異二聚硫酸化糖蛋白，牽涉到多種生物學功能，包括脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、衰老、補體級聯(lián)、膜循環(huán)、細胞黏附和細胞程序性死亡等[5, 13]。基于sCLU在抗凋亡、血管生成和促轉(zhuǎn)移方面的作用, sCLU被證實與肝癌的進程有關(guān)[15-16]。此外，鑒于其良好的診斷和預后表現(xiàn), sCLU也被推薦為多種癌癥的重要生物標志物[16-20]。AL-MAGHRABI J A等[16]研究發(fā)現(xiàn), CLU在子宮內(nèi)膜癌組織中表達上調(diào)，可作為診斷標志物，但是與疾病復發(fā)、生存或任何其他臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。CHEN Q F等[17]也發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清CLU水平顯著高于正常對照組，且與臨床分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、總生存率和無病生存率低有顯著相關(guān)性，提示血清CLU水平可能是診斷和評價乳腺癌化療敏感性的有效指標。有研究[18]稱，通過原位雜交檢測, sCLU在大鼠肝細胞中以低基礎(chǔ)水平表達，在肝細胞生長和促肝細胞分裂素的誘導下, sCLU表達上調(diào)。

既往研究[19-20]報道了使用免疫組織化學染色的人腫瘤組織中sCLU細胞質(zhì)過表達。本研究結(jié)果顯示，在癌旁肝組織中有類似的sCLU表達，在HCC組織的腫瘤細胞中有細胞質(zhì)和額外的微管分泌染色模式。本研究中, 55.29%的HCC組織表達sCLU, 38.94%的癌旁肝組織表達sCLU。本研究對癌旁肝組織中sCLU過表達與各種臨床病理參數(shù)進行了比較，結(jié)果顯示癌旁肝組織sCLU蛋白表達與肝功能惡化程度無關(guān)，因此其表達增加對HCC患者術(shù)后預后的影響可能只是與促癌分子機制有關(guān)，并不受肝硬化或纖維化的影響。本研究仍存在一些局限性: 本研究為單中心研究，樣本量相對較小; 本研究采用的數(shù)據(jù)庫主要基于HCC和乙肝病毒感染的患者隊列，應該考慮對HCC和主要HCV感染人群或有酗酒史的人群進行分層研究。

綜上所述，癌旁肝組織中的sCLU表達是與HCC患者術(shù)后無病生存和總生存都密切相關(guān)的獨立不良預后因素, sCLU在可切除HCC患者癌旁肝組織中表達上調(diào)，可作為HCC切除術(shù)后預防腫瘤復發(fā)的有效靶點。