夏德國, 顏克實, 陸大浩, 張 弛, 高 巨

(揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院, 1. 麻醉科, 2. 肝膽外科, 江蘇 揚州, 225000)

統(tǒng)計數(shù)據(jù)[1-2]顯示，目前中國新確診的肝癌患者約占全球新確診肝癌患者的50%, 且肝癌具有高病死率、高復(fù)發(fā)率及惡性程度高等特點，是腫瘤外科常見的惡性腫瘤。多數(shù)肝癌患者的早期臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，確診時已屬中晚期，治療效果不理想，并易發(fā)生并發(fā)癥[3]。瑞芬太尼是臨床上用于全身麻醉誘導(dǎo)或全身麻醉維持陣痛的麻醉藥，在胰腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤治療中均有應(yīng)用[4-5]。劉震等[6]研究結(jié)果顯示，舒芬太尼和瑞芬太尼均可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Notch信號通路主要包括Notch受體、Notch配體及下游基因Hes1, 在調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞分化、增殖和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用[7]。研究[8]顯示，姜黃素通過抑制、下調(diào)Notch1、NF-κB信號通路而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。本研究通過體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2, 探討瑞芬太尼通過Notch信號通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的可能性以及相關(guān)的機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

肝癌細(xì)胞HepG2購自中國科學(xué)院上海生物研究所; 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gbico公司; 鏈霉素、青霉素購自美國Hyclone公司; 注射用鹽酸瑞芬太尼購自江蘇恩華藥業(yè)公司(國藥準(zhǔn)字H20143314, 批號201802073); Notch通路抑制劑DAPT購自美國Sigma公司; CCK8試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒購自上海碧云天公司; 細(xì)胞周期試劑盒、凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物公司; p27抗體、Cyclin D1抗體、Bax抗體、cleaved cas-3抗體、Notch1抗體、Hes1抗體和GAPDH抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

將復(fù)蘇后的肝癌細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)至含有10%胎牛血清、雙抗(100 mg/L鏈霉素和100 kU/L青霉素)的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2, 消化后轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞板內(nèi)，接種密度為1×106個/孔。采用0、5、50、500 ng/mL的瑞芬太尼處理細(xì)胞，并設(shè)為瑞芬太尼的各劑量組; 選取500 ng/mL的瑞芬太尼和20 μmol/L的Notch通路抑制劑DAPT處理細(xì)胞，分別設(shè)為瑞芬太尼組、瑞芬太尼+DAPT組。

1.3 CCK8檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期的各組肝癌細(xì)胞HepG2, 制成細(xì)胞懸液后接種至96孔細(xì)胞板內(nèi)，每孔內(nèi)加入100 μL的細(xì)胞懸液，在培養(yǎng)箱內(nèi)固定培養(yǎng)48、72 h, 每孔添加10 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h, 取出后在酶標(biāo)儀450 nm處檢測細(xì)胞的光密度值(OD450 nm值)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡

1.4.1 細(xì)胞周期實驗: 取對數(shù)生長期的各組肝癌細(xì)胞HepG2, 在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h, 經(jīng)過離心后加入75%預(yù)冷的乙醇溶液，使其混勻后固定24 h, 加入1 mL PI和RNA酶，室溫培養(yǎng)30 min, 在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期分布情況。

1.4.2 細(xì)胞凋亡實驗: 取對數(shù)生長期的各組肝癌細(xì)胞HepG2, 制成單細(xì)胞懸液后接種在6孔細(xì)胞板內(nèi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h, 離心后收集細(xì)胞，加入1 mL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，按照凋亡試劑盒的說明步驟加入Annexin V-FITC/PI各5 μL, 混勻避光反應(yīng)15 min, 在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.5 Western blot檢測p27、Cyclin D1、Bax、cleavedcas-3和Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取對數(shù)生長期的各組肝癌細(xì)胞HepG2用于提取細(xì)胞的總蛋白，參照BCA試劑盒說明書定量蛋白濃度，上樣至SDS-PAGE凝膠電泳處理，轉(zhuǎn)膜，采用脫脂奶粉封閉培養(yǎng)2 h。洗膜后加入p27、Cyclin D1、Bax、cleaved cas-3、Notch1、Hes1和GAPDH抗體, 4 ℃孵育過夜，洗膜3次，加入二抗，室溫下孵育2 h，洗膜3次，最后滴加ECL化學(xué)液曝光處理，經(jīng)過Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響

采用0、5、50、500 ng/mL的瑞芬太尼處理肝癌細(xì)胞HepG2后，結(jié)果顯示，細(xì)胞的OD450 nm值逐漸降低, p27蛋白表達(dá)逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2中p27蛋白表達(dá)的影響

表1 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響

2.2 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2周期的影響

采用0、5、50、500 ng/mL的瑞芬太尼處理肝癌細(xì)胞HepG2后，結(jié)果顯示, G0/G1期細(xì)胞比率逐漸增加, S期細(xì)胞比率、Cyclin D1蛋白表達(dá)逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2中Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

表2 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2周期的影響

2.3 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

采用0、5、50、500 ng/mL的瑞芬太尼處理肝癌細(xì)胞HepG2后，結(jié)果顯示，細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved cas-3蛋白表達(dá)逐漸增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

A: 細(xì)胞凋亡率; B: 凋亡相關(guān)蛋白。圖3 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

表3 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

2.4 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2中Notch通路的影響

采用0、5、50、500 ng/mL的瑞芬太尼處理肝癌細(xì)胞HepG2后，結(jié)果顯示，細(xì)胞的Notch1、Hes1蛋白表達(dá)逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2中Notch通路的影響

表4 不同濃度的瑞芬太尼對肝癌細(xì)胞HepG2中Notch通路的影響

2.5 瑞芬太尼通過調(diào)控Notch通路對肝癌細(xì)胞HepG2增殖和周期的影響

與瑞芬太尼組相比，瑞芬太尼+DAPT組的OD450 nm值、S期細(xì)胞比率、Cyclin D1蛋白表達(dá)降低，G0/G1期細(xì)胞比率、p27蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 瑞芬太尼通過調(diào)控Notch通路對肝癌細(xì)胞HepG2中p27和Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

表5 瑞芬太尼通過調(diào)控Notch通路對肝癌細(xì)胞HepG2增殖和周期的影響

2.6 瑞芬太尼通過調(diào)控Notch通路對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

與瑞芬太尼組相比，瑞芬太尼+DAPT組的細(xì)胞凋亡率、Bax、cleaved cas-3蛋白表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6、表6。

A: 細(xì)胞凋亡率; B: 凋亡相關(guān)蛋白。圖6 瑞芬太尼通過調(diào)控Notch通路對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

表6 瑞芬太尼通過調(diào)控Notch通路對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

3 討 論

肝癌受多種因素的影響，其中病毒感染、環(huán)境污染、遺傳等是導(dǎo)致肝癌的主要原因[9]。臨床上治療肝癌的方法包括外科手術(shù)切除、化療、放療和免疫治療等，但是基于肝癌高侵襲率、高復(fù)發(fā)率和高病死率等特點，導(dǎo)致患者5年預(yù)后較差[10-11]。瑞芬太尼是一種有選擇性的μ阿片受體激動劑，在組織和細(xì)胞內(nèi)能夠快速水解，起效過程很快[12]。瑞芬太尼具有抗腫瘤的作用，孟楊等[13]研究結(jié)果顯示，瑞芬太尼通過上調(diào)miR-148a抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。孫成成等[14]研究結(jié)果顯示，瑞芬太尼通過調(diào)控miR-519d-3p/STAT3的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。唐優(yōu)仕等[15]研究結(jié)果顯示，瑞芬太尼通過抑制AKT信號通路而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，減弱端粒酶活性。孫輝平等[16]研究結(jié)果顯示，瑞芬太尼能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期。本研究采用不同濃度的瑞芬太尼處理肝癌細(xì)胞HepG2后，結(jié)果顯示，瑞芬太尼各劑量組可以抑制肝癌細(xì)胞的OD450 nm值，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，增加G0/G1期細(xì)胞比率，降低S期細(xì)胞比率，上調(diào)p27、Bax、cleaved cas-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Cyclin D1蛋白表達(dá)，說明瑞芬太尼可以明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

Notch信號通路是一個在進(jìn)化上高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最初發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，在脊椎動物和無脊椎動物中廣泛存在，可以參與腫瘤細(xì)胞的增殖、周期和凋亡等[17-18]。Notch家族主要有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4受體，可以與Notch受體DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2特異性結(jié)合使信號通路激活，進(jìn)而激活Hes家族的轉(zhuǎn)錄因子[19-20]。Notch1蛋白表達(dá)在肝癌細(xì)胞中上調(diào), miR-124通過抑制Notch1信號通路抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移[21]。岳犇等[22]研究結(jié)果顯示，激活Notch1/Jagged1信號通路可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。孫傳喜等[23]研究結(jié)果顯示, ADAM17通過Notch1/Hes1信號通路調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖。本研究采用不同濃度的瑞芬太尼處理肝癌細(xì)胞HepG2, 結(jié)果顯示各濃度的瑞芬太尼處理后的Notch1、Hes1蛋白表達(dá)下調(diào)。在加入Notch信號通路抑制劑DAPT處理細(xì)胞后, OD450 nm值、S期細(xì)胞比率降低, G0/G1期細(xì)胞比率、細(xì)胞凋亡率增加, p27、Bax、cleaved cas-3蛋白表達(dá)上調(diào), Cyclin D1蛋白表達(dá)下調(diào)，說明瑞芬太尼可以抑制Notch信號通路。

綜上所述，瑞芬太尼可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其作用可能通過抑制Notch信號通路實現(xiàn)。