祁增華，李 釩，丁 晟，楊 焜，田 豐

（軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院衛(wèi)勤保障技術(shù)研究所，天津 300161）

0 引言

外傷出血是戰(zhàn)現(xiàn)場(chǎng)最常見(jiàn)的傷情，不可控失血是導(dǎo)致傷員現(xiàn)場(chǎng)死亡的首要原因。即使失血傷員后送至醫(yī)院搶救，院前大量失血仍會(huì)造成較高的死亡率和嚴(yán)重的并發(fā)癥（如截肢等）[1]。因此，研究一種能夠快速、高效、救治火線傷員的止血器材意義重大。

由于環(huán)境的特殊性，海戰(zhàn)傷員的傷口極易接觸海水，而海水具有低溫、高滲、高鈉、高氯、偏堿性以及含菌量高等極特殊的理化特性[2]。一旦傷員受傷后傷口不及時(shí)處理經(jīng)海水浸泡，就會(huì)使傷員的傷情變得更加復(fù)雜，并且長(zhǎng)時(shí)間浸泡海水會(huì)給傷員全身都帶來(lái)非常嚴(yán)重的傷害。目前我軍應(yīng)用的創(chuàng)傷急救敷料、急救止血繃帶、自黏彈性繃帶等包扎止血器材均無(wú)法滿足高濕環(huán)境下的部隊(duì)保障需求，因此亟須研制一種可在高濕環(huán)境下使用的具備高效止血功能的材料，進(jìn)而為研制高濕環(huán)境下使用的包扎止血系列裝備奠定基礎(chǔ)。

海洋生物種類豐富多樣，是開(kāi)發(fā)生物材料的天然寶庫(kù)，許多海底生物所具有的特殊性能也賦予了研究學(xué)者諸多的研究靈感。盡管海岸邊海浪不斷，但是海洋貽貝依然表現(xiàn)出了強(qiáng)大的濕黏附能力。貽貝黏附蛋白中的鄰苯二酚基團(tuán)是其擁有濕黏附能力的關(guān)鍵。受貽貝黏附蛋白的啟發(fā)，研究人員研制了各種類型的聚合物模擬物，如聚乙烯亞胺-鄰苯二酚、殼聚糖-鄰苯二酚以及其他相關(guān)的鄰苯二酚聚合物[3]。

鄰苯二酚基團(tuán)來(lái)源廣泛，是一種多功能單體，常用于合成黏合劑和涂料。鄰苯二酚及其衍生物與有機(jī)或無(wú)機(jī)基質(zhì)相互作用近年來(lái)吸引了學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]。Hofman 等[5]合成了具有接枝兒茶酚基團(tuán)的聚氧雜環(huán)丁烷共聚物，鄰苯二酚基團(tuán)占15.5%（摩爾比）的聚合物對(duì)磨砂不銹鋼基體展示出5.59 MPa 的超強(qiáng)黏附作用，但是其潮濕表面的黏附能力顯著降低。Matos-Perez 等[6]合成了聚（3，4-二羥基苯乙烯-苯乙烯）共聚物，其在干燥表面黏合強(qiáng)度達(dá)到11 MPa，但是水下黏合強(qiáng)度僅為0.3 MPa。Lee 等[7]和Kahn 等[8]認(rèn)為含有鄰苯二酚的分子很容易被氧化為活性醌，活性醌可以發(fā)生自聚反應(yīng)形成交聯(lián)產(chǎn)物。除此之外，鄰苯二酚基團(tuán)也可以與膠原相互作用，其常常被引入膠原中以改善膠原性質(zhì)。

膠原是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱和血管等組織中。膠原分子可以自身交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)，形成的網(wǎng)絡(luò)限制了溶劑的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致膠原蛋白溶液可以轉(zhuǎn)化為水凝膠。膠原水凝膠具有高度膨脹的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以有效地負(fù)載生物活性分子和傳遞質(zhì)量。并且膠原水凝膠具有免疫原性低、生物活性好等優(yōu)點(diǎn)，常用作各種組織器官的藥物或組織工程給藥系統(tǒng)。然而，膠原水凝膠的一些缺點(diǎn)，如機(jī)械強(qiáng)度差、降解率快和熱穩(wěn)定性低限制了膠原水凝膠的發(fā)展和應(yīng)用。Koob 等[9]使用二鄰苯二酚去甲二氫愈創(chuàng)木酸交聯(lián)膠原纖維，使膠原纖維的剛度從1 MPa 增加到約582 MPa，其力學(xué)性能與正常肌腱相當(dāng)。Luo 等[10]構(gòu)建了一種兒茶酚/膠原共聚物膜，用于裝載一氧化氮供體。然而，關(guān)于兒茶酚及其衍生物修飾的膠原水凝膠的研究較少。Zhu 等[11]用聚多巴胺對(duì)膠原水凝膠進(jìn)行了改性，但結(jié)果并不令人滿意，膠原水凝膠的彈性模量?jī)H提高到250 Pa。Duan 等[12]結(jié)合戊二醛在增強(qiáng)膠原性質(zhì)方面的高效性，發(fā)現(xiàn)鄰苯二酚衍生物修飾的膠原能獲得具有理想性質(zhì)的水凝膠。其將3，4-二羥基苯甲醛（3，4-dihydroxybenzaldehyde，DB）加入膠原蛋白溶液中，然后用高碘酸鈉（NaIO4）將DB 的鄰苯二酚基團(tuán)氧化成醌，活性醌在膠原分子間聚合并形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而形成膠原水凝膠。研究結(jié)果表明，添加DB 使水凝膠的形態(tài)更加致密，抗酶性顯著增強(qiáng)。此外，細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，膠原水凝膠與DB 具有良好的生物相容性。這些數(shù)據(jù)表明，這種鄰苯二酚衍生物修飾的新型膠原水凝膠具有巨大的應(yīng)用潛力，但是鄰苯二酚衍生物修飾膠原的水凝膠在止血方面的研究還未被探索。

基于此，本研究擬利用貽貝仿生技術(shù)，模擬貽貝黏附蛋白，以3，4-二甲氧基苯乙烯（3，4-dimethoxystyrene，DMS）和4-乙烯基苯甲酸（4-vinyl benzoic acid，VBA）為原料合成鄰苯二酚共聚物P（DHS-co-VBA）。用聚苯乙烯骨架代替黏附蛋白中的聚酰胺鏈，在骨架上接枝鄰苯二酚來(lái)模擬黏附蛋白中的3，4-二羥基苯乙烯濕黏附基團(tuán)。之后與微纖維膠原進(jìn)行結(jié)合，探索通過(guò)仿生技術(shù)提升膠原的組織黏附性能，檢測(cè)復(fù)合材料的生物相容性，并通過(guò)體外凝血檢測(cè)、動(dòng)物止血模型進(jìn)一步評(píng)價(jià)其在高濕環(huán)境的止血效果[13]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

實(shí)驗(yàn)材料包括DMS、VBA、過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯化鈉（NaCl）、氯化氫（HCl）、三溴化硼（BBr3）、二甲基亞砜（dimethyl sulfo-xide，DMSO）、氯化鈣（CaCl2）和甲醇（CH4O），均來(lái)自阿拉丁公司。

實(shí)驗(yàn)儀器包括凝膠滲透色譜儀（GPC 1515，Waters，美國(guó)）、核磁共振波譜儀（AVANCE 400，BRUKER，德國(guó)）、傅里葉紅外光譜分析儀（Nicolet 380，Thermo，美國(guó)）、表面張力測(cè)量?jī)x（OCA20，Dataphysics，德國(guó)）、微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)（C42.503，美斯特，中國(guó)）、低溫恒溫反應(yīng)浴槽（XHDHJF-8002，霄漢，中國(guó)）。

1.2 樣品制備

由于鄰苯二酚基團(tuán)中的羥基十分活躍，在制備過(guò)程中首先通過(guò)甲氧基將鄰苯二酚基團(tuán)中的羥基保護(hù)起來(lái)，隨后對(duì)甲氧基進(jìn)行脫保護(hù)，得到實(shí)驗(yàn)所需要的羥基。

（1）聚[（3，4-二甲氧基苯乙烯）-共聚-4-（乙烯基苯甲酸）][P（DMS-co-VBA）]制備。

首先利用固相萃取柱將VBA 中多余的阻聚劑去除。將1 g DMS 和5 mL VBA 加入裝有60 mL 蒸餾水的三口燒瓶中進(jìn)行乳液聚合反應(yīng)。反應(yīng)物加熱至60 ℃后，將64 mg 引發(fā)劑K2S2O8溶解在2 mL 水中后滴加至三口燒瓶中，并在氬氣保護(hù)的氛圍下于60 ℃攪拌24 h 后加入1 mL CH4O 終止聚合。進(jìn)一步加入5 g NaCl 破乳沉淀，通過(guò)離心得到固體不溶物[14]，再使用CH4O 溶解后離心得到沉淀。此操作重復(fù)2～3次后，將得到的沉淀通過(guò)冷凍干燥劑除去多余的液體后，得到P（DMS-co-VBA）粉末。P（DMS-co-VBA）合成示意圖如圖1 所示。

圖1 P（DMS-co-VBA）合成示意圖

（2）P（DHS-co-VBA）的制備。

將2 g P（DMS-co-VBA）粉末溶解在50 mL CH2Cl2中。在氬氣保護(hù)的氛圍下，將反應(yīng)溫度冷卻至-10 ℃，維持10 min，然后在10 min 內(nèi)逐滴加入3 mL BBr3，并不斷攪拌。用300 mL 的1%HCl 分3 次重復(fù)洗滌處理該聚合物，然后在80 ℃烘箱干燥得到共聚物P（DHS-co-VBA）固體顆粒。P（DHS-co-VBA）合成示意圖如圖2 所示。

圖2 P（DHS-co-VBA）合成示意圖

（3）共聚物/膠原水凝膠制備。

將20 mg 的P（DHS-co-VBA）固體顆粒溶解在DMSO 與去離子水的混合溶劑中（體積比1∶1），加入一定質(zhì)量的微纖維膠原，攪拌共混，然后在80 ℃烘箱蒸發(fā)部分溶劑，制得P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠。

1.3 材料物化性能的表征

1.3.1 凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）

首先將待測(cè)樣品提前1 d 用氘代DMSO 溶劑溶解，之后將柱溫設(shè)置為40 ℃、檢測(cè)室的溫度設(shè)置為40 ℃，用普魯士多糖作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將示差檢測(cè)器的流速設(shè)置為1 mL/min 后，用凝膠滲透色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）氫譜

使用干燥、清潔、高質(zhì)量的核磁管，以避免污染樣品及勻場(chǎng)過(guò)程中引入不必要的麻煩。對(duì)樣品進(jìn)行充分的干燥和提純，避免雜質(zhì)峰掩蓋有用信號(hào)，同時(shí)樣品中不能混有磁性雜質(zhì)，否則會(huì)扭曲磁場(chǎng)而降低譜峰的分辨力。用5～10 mg 固體樣品蓋住核磁管底部后，用氘代DMSO 試劑0.5 mL 進(jìn)行溶解，氘代試劑溶解后用核磁共振波譜儀進(jìn)行氫譜的測(cè)試，并掃描16 次得到NMR 氫譜。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）

使用溴化鉀壓片法，先將樣品置于80 ℃干燥箱充分干燥后，取少量樣品以1∶100 的比例與溴化鉀在研缽中混勻后置于不銹鋼壓模中壓片成型，之后采用傅里葉紅外光譜分析儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜分析，以分辨力0.09 cm-1、掃描范圍4000～400 cm-1觀察樣品對(duì)波譜的吸收情況。

1.4 親疏水性檢測(cè)

打開(kāi)接觸角測(cè)試儀和相連接的計(jì)算機(jī)，滴液量盡量控制在1～5 μL 以內(nèi)，因?yàn)榈我哼^(guò)多，液滴受重力影響會(huì)產(chǎn)生變化，不是一個(gè)正規(guī)的圓形或者橢圓形，影響測(cè)試結(jié)果。將樣品置于樣品臺(tái)上，需根據(jù)實(shí)際操作情況調(diào)節(jié)光源明暗度，太亮?xí)?dǎo)致液滴外輪廓不清晰，太暗則導(dǎo)致液滴變大或者周圍太多黑點(diǎn)，影響測(cè)試數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。打開(kāi)軟件后進(jìn)行自動(dòng)滴液，然后上升樣品臺(tái)接液基線位置，原則上一鍵式測(cè)量是自動(dòng)找出基線進(jìn)行測(cè)試，特殊情況無(wú)法識(shí)別出基線的，需要操作人員手動(dòng)找尋基線。接液完成后，完成水接觸角的測(cè)試。

1.5 樣品干濕黏附強(qiáng)度分析

以玻璃作為干表面的黏附基底、浸水豬皮作為濕組織表面的黏附基底，從市場(chǎng)購(gòu)買聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）型和環(huán)氧樹(shù)脂型黏合劑，通過(guò)設(shè)計(jì)搭接剪切對(duì)比實(shí)驗(yàn)測(cè)試P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠的黏附強(qiáng)度[5]，具體操作如下：

截取2 塊尺寸為70 mm×25 mm 的黏附基底，將0.5 mL（0.1 g/mL）的膠黏劑溶液涂在一塊基底上。然后將涂有膠黏劑的部分搭接在一起，輕輕揉搓使混合均勻（搭接面積為25 mm×25 mm）。24 h 后對(duì)涂有膠黏劑的基底進(jìn)行搭接剪切測(cè)試，拉伸速率為2 mm/min，直到2 塊基底被拉開(kāi)[15]。搭接剪切強(qiáng)度的計(jì)算公式為a=P/（b×c），式中，a 為搭接剪切強(qiáng)度（MPa）；P 為最大拉伸作用力（N）；b 和c 分別為搭接區(qū)域的長(zhǎng)度和寬度（mm）。

1.6 樣品細(xì)胞毒性測(cè)試

1.6.1 細(xì)胞增殖率

利用小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行毒性試驗(yàn)，設(shè)計(jì)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）對(duì)照組及4組P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品實(shí)驗(yàn)組，并選用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中常用的2 個(gè)濃度進(jìn)行試驗(yàn)。其中實(shí)驗(yàn)組1 為10 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）樣品（與細(xì)胞孵育后濃度），實(shí)驗(yàn)組2 為10 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品，實(shí)驗(yàn)組3為50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）樣品，實(shí)驗(yàn)組4 為50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品。每組設(shè)置4 組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試[16-18]，具體操作如下：

（1）將1×104個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞接種在杜爾貝科培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中，并在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育24 h。

（2）去除原培養(yǎng)液，將一定體積的細(xì)胞（密度為2500 個(gè)/cm2）放置于24 孔板中，共計(jì)2 板，培養(yǎng)基為DMEM 加入青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL）、10%的胎牛血清。在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。

（3）加入細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting Kit-8，CCK-8），孵育4 h 后，棄去培養(yǎng)基，并替換為150 μL的DMSO，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞增殖率[19]。

1.6.2 死活細(xì)胞染色

死活細(xì)胞染色具體操作如下：

（1）將1×104個(gè)小鼠成纖維細(xì)胞接種在DMEM中，在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育24 h。

（2）去除原培養(yǎng)液，將一定體積的細(xì)胞（密度為2500 個(gè)/cm2）放置于24 孔板中，共計(jì)1 板，培養(yǎng)基為DMEM 中加入青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL）、10%的胎牛血清。在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

（3）加入死活細(xì)胞染色劑鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（一種具有細(xì)胞膜滲透性的活細(xì)胞熒光染料，呈綠色熒光）和碘化丙啶（其僅能穿過(guò)死細(xì)胞膜的無(wú)序區(qū)域到達(dá)細(xì)胞核，嵌入細(xì)胞的DNA 雙螺旋區(qū)域，并產(chǎn)生紅色熒光）。在37 ℃水浴下孵育15 min 后，使用熒光顯微鏡放大50 倍捕獲圖像。

1.7 樣品止血性能測(cè)試

1.7.1 體外全血凝固時(shí)間（CBT）檢測(cè)

CBT 是一種能直觀反映凝血性能的基礎(chǔ)性檢測(cè)。在新西蘭兔的血液樣本中加入3.8%的檸檬酸鈉，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，在3 個(gè)5 mL 玻璃管中分別加入20 mg P（DHS-co-VBA）[P（DHS-co-VBA）組]、20 mg 微纖維膠原（膠原組）、10 mg 微纖維膠原與10 mg P（DHS-co-VBA）（樣品組），空白對(duì)照組中不添加任何物質(zhì)。然后在37 ℃水浴下孵育5 min，取1 mL 兔血與樣品混合，37 ℃水浴下孵育3 min，取0.5 mL 0.025 mol/L 的CaCl2水溶液加入管中觸發(fā)凝血，將試管從水浴中取出，每隔15 s 倒轉(zhuǎn)1 次，直到試管中的血液不再流動(dòng)[20]。

1.7.2 兔肝損傷模型止血實(shí)驗(yàn)

設(shè)置空白對(duì)照組、膠原實(shí)驗(yàn)組和P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實(shí)驗(yàn)組，每組3 只白兔。空白對(duì)照組不添加任何止血材料，膠原實(shí)驗(yàn)組微纖維膠原用量為0.2 g，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠組利用注射器將1 mL 的樣品注入到傷口表面，其中樣品中P（DHS-co-VBA）和微纖維膠原各0.1 g。實(shí)驗(yàn)前1 d，所有白兔必須禁食，但是不禁水。實(shí)驗(yàn)前，將白兔以仰臥的形式固定在實(shí)驗(yàn)手術(shù)臺(tái)上，肌肉注射10%的陸眠寧，用藥量0.75 mL/kg；待白兔麻醉后，在腹部作備皮處理并且進(jìn)行酒精消毒；隨后沿中線剖腹，將兔肝組織完全暴露，用無(wú)菌紗布吸去多余的腹水及血液。在兔肝上葉取下直徑約1.2 cm、深度約1 mm 的組織，形成出血?jiǎng)?chuàng)面；在傷口自然出血3 s 后，用無(wú)菌紗布吸去流出的血液，然后立即將止血材料完全覆蓋于創(chuàng)面，如圖3 所示。隨后每隔30 s觀察一次出血情況，用已稱重的無(wú)菌紗布吸去創(chuàng)面周圍滲血，當(dāng)在止血材料表面觀察不到有血液滲出，且保持30 s 仍然不再出血時(shí)，認(rèn)為出血已得到控制，實(shí)驗(yàn)結(jié)束，并記錄下止血時(shí)間[21]。取下傷口處的止血材料及無(wú)菌紗布后進(jìn)行稱重，根據(jù)所用敷料的原始質(zhì)量和止血后質(zhì)量的差值，計(jì)算失血量。

圖3 兔肝損傷模型止血實(shí)驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 材料的物化性能表征結(jié)果

2.1.1 GPC

通過(guò)對(duì)圖4 進(jìn)行分析處理可以得到GPC 的結(jié)果，結(jié)果顯示，P（DHS-co-VBA）的數(shù)均分子量為5023，重均分子量為7162，黏均分子量為6771，P（DHS-co-VBA）的多分散性指數(shù)為1.42584，分散性較好，證明聚合物已成功制備。

圖4 P（DHS-co-VBA）分子量的分布曲線

2.1.2 NMR 氫譜

如圖5 所示，NMR 氫譜與目標(biāo)聚合物一致，其中化學(xué)位移ppm 6.5～8 為苯環(huán)上H 的位移，ppm 12.9左右為羧基H 位移，P（DMS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果中ppm 3.5～4 表現(xiàn)為甲氧基的H 的位移，而該位置的峰在圖6 中P（DHS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果中消失，同時(shí)P（DHS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果同時(shí)出現(xiàn)酚羥基的位移峰。說(shuō)明P（DHS-co-VBA）已成功脫去甲氧基，在還原的過(guò)程中，鄰苯二酚基團(tuán)裸露在外。

圖5 P（DMS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果

圖6 P（DHS-co-VBA）的NMR 氫譜結(jié)果

2.1.3 FTIR

P（DMS-co-VBA）與P（DHS-co-VBA）的FTIR圖顯示（如圖7 所示），P（DHS-co-VBA）在1200～1300 cm-1和2500～2800 cm-1處有吸收峰，這表明P（DHS-co-VBA）共聚物表面含有大量的羧基、羥基活性基團(tuán)。P（DMS-co-VBA）在2950 cm-1處的甲氧基吸收峰在還原過(guò)程中消失，也證實(shí)了鄰苯二酚基團(tuán)的成功制備。

圖7 P（DMS-co-VBA）與P（DHS-co-VBA）的FTIR 圖

2.2 親疏水性檢測(cè)

如圖8 所示，通過(guò)測(cè)試，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料水接觸角為73.5°，說(shuō)明P（DHSco-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料較為親水，可能與P（DHS-co-VBA）表面含有大量的羧基與鄰苯二酚等親水性基團(tuán)相關(guān)。

圖8 水接觸角檢測(cè)圖

2.3 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠形態(tài)及性能

如圖9 所示，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原呈水凝膠的形態(tài)，膠原因共聚物黏附力吸附在水凝膠的內(nèi)部及表面，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原整體也有很強(qiáng)的黏附力，用手指拉伸一段距離后，呈絲狀連接。

圖9 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實(shí)物圖

2.4 樣品干濕黏附強(qiáng)度分析

由圖10 可知，以玻璃為黏附基底，PVC 型黏合劑的峰值平均載荷為（44.2±3.3）N[如圖10（a）所示]，經(jīng)過(guò)計(jì)算搭接剪切的強(qiáng)度為（70.7±5.2）kPa；環(huán)氧樹(shù)脂型黏合劑的峰值平均載荷為（326.4±16.6）N[如圖10（b）所示]，經(jīng)過(guò)計(jì)算搭接剪切的強(qiáng)度為（522.3±26.6）kPa；P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的峰值平均載荷為（117.4±7.8）N[如圖10（c）所示]，經(jīng)過(guò)計(jì)算搭接剪切的強(qiáng)度為（187.9±12.5）kPa。由圖10（d）可知，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的黏附強(qiáng)度高于PVC 型黏合劑，低于環(huán)氧樹(shù)脂型黏合劑。由此說(shuō)明P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品在干表面具有一定的黏附強(qiáng)度。

由圖11 可知，在浸水豬皮黏附基底黏附強(qiáng)度檢測(cè)中，PVC 型黏合劑的峰值平均載荷為（8.6±0.8）N[如圖11（a）所示]，經(jīng)過(guò)計(jì)算搭接剪切的強(qiáng)度為（13.8±1.3）kPa；環(huán)氧樹(shù)脂型黏合劑的峰值平均載荷為（8.8±3.0）N[如圖11（b）所示]，經(jīng)過(guò)計(jì)算搭接剪切的強(qiáng)度為（14.1±0.4）kPa；P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的峰值平均載荷為（114.3±3.9）N[如圖11（c）所示]，經(jīng)過(guò)計(jì)算搭接剪切的強(qiáng)度為（182.8±6.3）kPa。由圖10（d）與圖11（d）發(fā)現(xiàn)，制備的P（DHSco-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品具有較強(qiáng)的濕黏附性能，基本與干表面的黏附強(qiáng)度一致，而市售的黏合劑雖然在干表面表現(xiàn)出很強(qiáng)的黏附效果，但是在濕表面表現(xiàn)不佳。

圖10 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品與其他樣品在玻璃干表面的黏附強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果

圖11 P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品與其他樣品在浸水豬皮表面的黏附強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果

2.5 樣品細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果

2.5.1 細(xì)胞增殖率

如圖12 所示，當(dāng)細(xì)胞與檢測(cè)樣品孵育24 h 后，通過(guò)吸光度檢測(cè)計(jì)算PBS 對(duì)照組的細(xì)胞存活率接近100%，10 與50 mg/mL 所有實(shí)驗(yàn)樣品的細(xì)胞存活率均大于90%，說(shuō)明制備的P（DHS-co-VBA）及P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠樣品的細(xì)胞毒性低，生物相容性良好。即使在50 mg/mL 的濃度下，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料也表現(xiàn)出良好的生物相容性，細(xì)胞毒性均小于2 級(jí)。

圖12 CCK-8 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

2.5.2 死活細(xì)胞染色結(jié)果

如圖13 所示，死活細(xì)胞染色結(jié)果與細(xì)胞存活率測(cè)試結(jié)果一致，可以明顯地看出，50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）及50 mg/mL 的P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠只有少部分的細(xì)胞死亡，同樣證實(shí)了制備的水凝膠材料具有很好的細(xì)胞相容性。

圖13 死活細(xì)胞染色結(jié)果（鈣黃綠素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶染色，50×）

2.6 樣品止血性能測(cè)試結(jié)果

2.6.1 CBT 檢測(cè)

如圖14 所示，空白對(duì)照組的凝血時(shí)間為（69.0±3.6）s，P（DHS-co-VBA）組的凝血時(shí)間為（61.3±7.8）s，膠原組的凝血時(shí)間為（68.7±1.5）s，樣品組的凝血時(shí)間為（63.7±5.7）s。雖然經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，P（DHS-co-VBA）組、膠原組以及樣品組都與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異，但是通過(guò)凝血時(shí)間數(shù)據(jù)對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，單純的微纖維膠原材料幾乎并未改變兔血的凝血時(shí)間，而P（DHS-co-VBA）可以縮短兔血的凝血時(shí)間，同樣P（DHSco-VBA）與微纖維膠原的混合物也可以縮短兔血的凝血時(shí)間，只是縮短時(shí)間的效果未達(dá)到顯著差異。說(shuō)明復(fù)合水凝膠具備一定的凝血效果，且較單一的微纖維膠原樣品凝血效果進(jìn)一步提升，說(shuō)明P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠有助于實(shí)現(xiàn)血液的凝固，可能與鄰苯二酚基團(tuán)產(chǎn)生的濕黏附效果有關(guān)。

圖14 CBT 檢測(cè)結(jié)果

2.6.2 兔肝損傷模型止血實(shí)驗(yàn)

由表1、圖15 和圖16 可以看出，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實(shí)驗(yàn)組的平均止血時(shí)間為（182.7±34.8）s，平均失血量為（2.097±0.966）g；膠原實(shí)驗(yàn)組的平均止血時(shí)間為（191.3±27.3）s，平均失血量為（2.569±0.404）g。在止血時(shí)間方面，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實(shí)驗(yàn)組基本與膠原實(shí)驗(yàn)組一致并且遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組；在失血量方面，P（DHS-co-VBA）/微纖維膠原水凝膠實(shí)驗(yàn)組遠(yuǎn)低于空白對(duì)照組，略低于膠原實(shí)驗(yàn)組。由于微纖維膠原在止血過(guò)程中吸收了大量的血液并凝結(jié)，在后續(xù)失血計(jì)算中難以估算材料內(nèi)部吸收的血量，因此實(shí)際失血量要比可計(jì)算的失血量的數(shù)值還要大。整體而言，P（DHSco-VBA）/微纖維膠原水凝膠材料在止血性能方面優(yōu)于純微纖維膠原。

圖16 各組失血量對(duì)比

表1 各組止血時(shí)間及失血量測(cè)試結(jié)果

圖15 各組止血時(shí)間對(duì)比

3 結(jié)語(yǔ)

本研究合成了鄰苯二酚類的仿生濕黏材料，并與微纖維膠原材料復(fù)合制備了水凝膠材料，探索了鄰苯二酚/微纖維膠原水凝膠材料在濕面組織的黏附強(qiáng)度和止血性能，并從生物相容性、體外凝血和動(dòng)物創(chuàng)傷模型3 個(gè)方面評(píng)價(jià)了鄰苯二酚/微纖維膠原水凝膠作為止血材料的可行性。研究結(jié)果表明，鄰苯二酚/微纖維膠原水凝膠止血材料在高強(qiáng)黏附、快速止血、封閉創(chuàng)面方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，有望實(shí)現(xiàn)戰(zhàn)創(chuàng)傷快速止血，進(jìn)一步提升我軍的衛(wèi)勤保障能力。

本研究還有些許不足：（1）微纖維膠原與P（DHSco-VBA）是共混方式，并不是十分穩(wěn)定，如果采用共價(jià)連接會(huì)使材料更加穩(wěn)定。（2）P（DHS-co-VBA）在水中溶解性差，需將P（DHS-co-VBA）溶解在有機(jī)試劑中使用，因此會(huì)影響共聚物的細(xì)胞毒性。因此下一步的研究方向是首先制備可溶于水的鄰苯二酚共聚物，并利用微纖維膠原與共聚物中的活性基團(tuán)共價(jià)耦連，持續(xù)優(yōu)化制備工藝，研制濕黏附強(qiáng)度更大的聚合材料。其次因?yàn)閺?qiáng)大的黏附效果必然加大黏附劑在傷口處的剝離難度，因此需研制一種黏附性能可控的止血材料，實(shí)現(xiàn)黏附強(qiáng)度的精準(zhǔn)調(diào)控。