許月欣 經(jīng) 莉 閆洪超 孫潔蕓 嚴園園 楊凌辰

高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因[1]。研究表明，人類乳頭瘤病毒的流行包括偶發(fā)感染和缺乏清除持續(xù)感染的混合，80%女性中一生有HPV感染，但在感染兩年內(nèi)自然消退的女性占90%左右，發(fā)展為子宮頸癌前病變和子宮頸癌的女性僅為1%[2]。當(dāng)HPV-DNA整合到宿主染色體時，HPV不易清除而呈現(xiàn)持續(xù)性的感染，發(fā)展為宮頸癌前病變和宮頸癌[3]。研究顯示，由HPV16和18亞型導(dǎo)致的宮頸癌占60%～70%[4]。E6/E7為病毒早期癌基因，其過度合成及功能啟動為宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素[5]。此外，宿主免疫狀態(tài)也與HPV感染、宮頸癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6]。TRIM25是TRIM家族成員之一，其作為雙重調(diào)節(jié)因子，在宿主抗病毒免疫和惡性腫瘤的演變過程中發(fā)揮重要作用[7]。因此TRIM25可能對HPV感染的宮頸疾病發(fā)揮抗病毒免疫，甚至在阻止宮頸上皮惡變中發(fā)揮作用。本研究通過檢測不同宮頸組織中HPV16/18 E6和TRIM25蛋白表達情況，探討兩者在宮頸癌中的聯(lián)系及與患者臨床病理資料和預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

1.一般資料:選取2014年6月～2016年6月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科治療的105例宮頸癌患者，患者年齡28～68歲，平均年齡48歲，同期收集50例慢性宮頸炎組，患者年齡38～54歲，平均年齡46歲；58例CINI、62例CINⅡ～Ⅲ組，患者年齡26～60歲，平均年齡45歲。所有患者病例資料完整。納入標準：①所以標本均由病理明確；②無合并其他類型的惡性腫瘤；③術(shù)前無接受放化療史。排除標準：①存在影響預(yù)后的慢性疾病史；②臨床資料不完整?；颊呔炇鹬橥鈺艺鞯冕t(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會的批準(倫理審批號：XYFY2021-KL219)。

2.試劑：超敏兩分法檢測試劑盒(PV-9001)、DAB試劑盒選自徐州康美生物科技公司；HPV16/18 E6及TRIM25抗體選自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

3.實驗方法：采用免疫組化法檢測，主要實驗步驟：石蠟切片標本置于烘箱中(70℃，1h)；二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化；檸檬酸鈉緩沖液高壓修復(fù)15min；3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10min；滴加一抗4℃孵育過夜；37℃孵育二抗；DAB對比顯色,陰性對照中采用PBS緩沖液替代一抗處理；蘇木精復(fù)染；常規(guī)脫水、透明、封片、閱片。

4.免疫組化結(jié)果判斷標準：HPV16/18 E6陽性結(jié)果表現(xiàn)為細胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒。TRIM25陽性結(jié)果表現(xiàn)為細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。由兩名高年資病理科醫(yī)生采用雙盲法進行顯微鏡下閱片。隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞數(shù)百分比(PP)：<5%計0分，5%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分。染色強度(SI)：無著色0分，淡黃色1分，深黃色2分，棕褐色3分。最后綜合陽性細胞數(shù)及細胞染色強度決定最終的評分，總得分：0分、1～4分、5～8分、9～12分分別表示-、+、++、+++。

5.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析。計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析；繪制Kaplan-Meier曲線進行生存分析；COX回歸分析影響患者預(yù)后的危險因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.HPV16/18 E6和TRIM25蛋白在不同宮頸組織中的表達情況:HPV16/18 E6蛋白陽性率表達在不同宮頸組織中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。宮頸癌組中HPV16/18 E6蛋白表達陽性率高于CIN Ⅱ～Ⅲ、CIN Ⅰ和慢性宮頸炎組，HPV16/18 E6蛋白表達在CIN Ⅱ～Ⅲ組中陽性率高于慢性宮頸炎組；TRIM25蛋白陽性率表達在不同宮頸組織中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TRIM25蛋白表達陽性率在宮頸癌組低于CIN Ⅰ和慢性宮頸炎組，詳見表1。

表1 不同宮頸組織中HPV16/18 E6與TRIM25的陽性率比較[n(%)]

2.HPV16/18 E6和TRIM25在宮頸癌組織中表達的相關(guān)性:HPV16/18 E6和TRIM25在宮頸癌組織中表達呈負相關(guān)(r=0.453),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.005)。

3.HPV16/18 E6、TRIM25的表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系：105例宮頸癌患者中85例行手術(shù)治療，術(shù)中清掃淋巴結(jié)；20例接受放化療等抗腫瘤治療,宮頸癌患者HPV16/18 E6的表達與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)(P均<0.05)；TRIM25的表達與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，詳見表2。

表2 HPV16/18 E6和TRIM25表達與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

4.HPV16/18 E6和TRIM25蛋白的表達與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系:對105例宮頸癌患者進行門診、電話等多種方式隨訪，隨訪時間為3～60個月。利用Kaplan-Meier生存分析方法，HPV16/18 E6蛋白陽性表達患者的平均生存時間顯著短于陰性表達患者(P<0.05)。TRIM25蛋白陽性表達患者的平均生存時間顯著長于陰性表達患者(P<0.05，圖1)。

圖1 HPV16/18 E6、TRIM25表達與總體生存率關(guān)系A(chǔ).HPV16/18 E6表達與總體生存率關(guān)系；B.TRIM25表達與總體生存率關(guān)系

4.探討子宮頸癌患者預(yù)后相關(guān)影響因素：單因素回歸分析結(jié)果顯示，患者組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期、HPV16/18 E6和TRIM25的表達與患者預(yù)后相關(guān)(P均<0.05)。COX多因素生存分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV16/18 E6是影響患者生存的獨立危險因素，TRIM25是影響患者生存的獨立保護因素(表3)。

表3 COX回歸分析宮頸癌患者的預(yù)后影響因素

討 論

宮頸癌是女性第4位常見癌癥，據(jù)統(tǒng)計，在我國宮頸癌發(fā)生率位居我國女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌[8]。人乳頭瘤病毒感染和病毒基因組整合到宿主染色體是宮頸腫瘤進展的早期事件[9]。E6是HPV主要致癌蛋白，一旦整合，病毒蛋白質(zhì)破壞宿主細胞，通過多種機制在宮頸惡性發(fā)展中發(fā)揮作用。P53是人體重要的抑癌基因，P53促進DNA修復(fù)而維持基因組完整性。在宮頸病變中，E6蛋白過度表達將導(dǎo)致P53 蛋白降解，細胞不能修復(fù)受損DNA，抑制細胞凋亡，導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化[10]。其次E6與端粒酶活性升高有關(guān)。癌細胞上調(diào)端粒酶，可以無限增殖或具有永生化特性。E6蛋白通過抑制Myc相關(guān)鋅指蛋白、使hTERT啟動子區(qū)CpG島的DNA堿基低甲基化而上調(diào)端粒酶[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，E6參與病毒免疫逃逸，當(dāng)機體感染病毒后，干擾素調(diào)節(jié)因子與病毒反應(yīng)元件和干擾素刺激元件結(jié)合，發(fā)揮抗病毒作用，E6通過下調(diào)干擾素調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致細胞無法做出抗病毒反應(yīng)[9]。深入研究HPVE6致癌機制，針對HPVE6靶向治療有望在宮頸癌防治中發(fā)揮重要作用[12]。

HPV16/18 E6反應(yīng)病毒在人體細胞內(nèi)活性狀態(tài)，HPV16/18 E6陽性率與宮頸病變程度呈正相關(guān)。這與國內(nèi)外研究一致，HPV16/18 E6陽性率的升高提示癌前病變及宮頸癌發(fā)病風(fēng)險的提高[13]。進一步研究分析發(fā)現(xiàn)HPV16/18 E6陽性率與宮頸癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑相關(guān)。推測在低分化和大瘤體宮頸癌組織中E6蛋白復(fù)制速率高，阻斷細胞凋亡，逃避細胞周期檢查點而使細胞無限制增殖。血管生成發(fā)生在癌前階段，引起內(nèi)皮細胞增殖、分化和遷移，與腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)HPV16/18 E6蛋白陽性表達的宮頸癌患者的總生存時間短于陰性者，其過表達與宮頸癌患者不良預(yù)后有關(guān)。

TRIM25是TRIM家族成員之一，可催化多種靶蛋白PTEN、P53、維甲酸誘導(dǎo)基因1(RIG-1)等多聚泛素化修飾，調(diào)控細胞增殖與遷徙、調(diào)節(jié)人體內(nèi)天然免疫、防御病毒等。TRIM25在雌激素相關(guān)的細胞增殖和器官發(fā)育中不可或缺，因此又稱雌激素反應(yīng)性指蛋白。研究發(fā)現(xiàn)TRIM25與雌激素反應(yīng)相關(guān)的乳腺癌增殖有關(guān)，且與乳腺癌患者的預(yù)后不良具有相關(guān)性[15]。TRIM25在子宮正常生長與分化中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)破壞小鼠TRIM25基因后，小鼠子宮對雌激素反應(yīng)下降，出現(xiàn)子宮不發(fā)育情況[16]。此外，TRIM25蛋白在卵巢癌、肝癌、胃癌和肺癌等腫瘤中呈過表達，但在子宮內(nèi)膜癌中低表達，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用[17，18]。同時TRIM家族蛋白參與抗病毒固有免疫，發(fā)揮非特異廣譜殺病毒功能并啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TRIM25介導(dǎo)RIG-1泛素化啟動，促進RIG-1與MAVS的相互作用。RIG-1是一種重要的模式識別受體，即細胞質(zhì)RNA傳感器，它能感知病毒，并與線粒體適配器MAVS相互作用，觸發(fā)信號級聯(lián)，導(dǎo)致I型干擾素(IFNs)的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，一種新的HPV介導(dǎo)的免疫逃避機制，HPVE6癌蛋白靶向RIG-1的上游激活因子TRIM25和泛素特異性蛋白酶15(USP15)，促進TRIM25降解，抑制RIG-1激活和抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[19～21]。

TRIM25可能在HPV感染相關(guān)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，隨著宮頸病變程度增加，TRIM25陽性率下降,提示在HPV感染早期機體TRIM25表達發(fā)揮抗病毒作用，病毒在持續(xù)感染過程中，E6癌基因組整合，TRIM25降解導(dǎo)致病毒免疫逃逸的發(fā)生，從而加劇細胞惡性轉(zhuǎn)化。Spearman相關(guān)分析顯示，宮頸癌組中HPV16/18 E6蛋白和TRIM25蛋白表達呈負相關(guān),HPV16/18 E6和TRIM25共同參與宮頸病變的發(fā)生、發(fā)展。進一步研究分析發(fā)現(xiàn)TRIM25陽性表達率在宮頸癌組織中隨著組織分化程度降低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而呈下降趨勢。本研究還發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者TRIM25蛋白陰性表達的總生存時間短于陽性者，TRIM25蛋白低表達與宮頸癌患者不良預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，HPV16/18 E6和TRIM25共同參與了從CIN到宮頸癌的發(fā)生過程，有望成為評估宮頸病變進展及預(yù)后指標。TRIM25抗病毒通路可能成為HPV感染及宮頸癌靶向治療的潛在靶點。本研究僅從臨床角度探究其表達意義，其是否具有阻止腫瘤細胞分化和促進細胞凋亡的作用仍需開展深入實驗予以進一步證實。