孟 希 謝 平

低溫療法廣泛應用于臨床醫(yī)學，特別是對于嚴重腦卒中、顱腦外傷以及一些重要器官缺血再灌注后的保護。冷凍療法也運用于在皮膚科、器官移植以及生殖醫(yī)學等領(lǐng)域，在一定程度上可以降低手術(shù)風險、延長器官的生存時間。對眼科而言，低溫常運用于眼庫中移植物的保存；內(nèi)眼手術(shù)時局部降溫有助于保護角膜內(nèi)皮和視網(wǎng)膜組織；通過冷凝術(shù)治療難治性青光眼和視網(wǎng)膜裂孔等。本文將簡述低溫治療的發(fā)展歷史、作用機制，并就低溫在眼科疾病中的應用做一綜述。

一、低溫治療的發(fā)展簡史

人類開始應用低溫治療疾病，最早可追溯到公元前3500年，據(jù)記載當時的醫(yī)師Edwin Smith Papyrus已開始運用局部低溫修復傷口；公元前2000年，古埃及人發(fā)現(xiàn)冷敷可獲得良好的鎮(zhèn)痛效果；拿破侖時期為了減輕因戰(zhàn)傷截肢的痛苦，軍醫(yī)將傷者放在冰水中行手術(shù)操作。

20世紀以來，低溫在臨床中得到更廣泛的應用：1950年美國杜克大學Sealy教授首先將低溫運用于心臟灌注手術(shù)；Bigelow等研究發(fā)現(xiàn)，降低患者體表溫度可明顯改善心肺衰竭，低溫療法被迅速推廣及并用于心血管外科手術(shù)；1964年國際低溫生物學和低溫醫(yī)學會正式成立；20世紀90年代初期固體二氧化碳、液氮開始應用于臨床，冷凍醫(yī)療初見雛形；隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，低溫醫(yī)學日趨成熟。

二、低溫治療的作用機制

1.低溫對細胞代謝的影響：研究發(fā)現(xiàn)低溫通過降低細胞耗氧量、影響線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能等方面發(fā)揮對于器官的保護作用。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)通過與二磷酸腺苷相互轉(zhuǎn)化實現(xiàn)貯能和放能，為細胞生命活動供能。線粒體作為合成ATP的重要場所，其正常功能需要一系列酶的參與，而細胞內(nèi)許多酶的活性在低溫下降低。Simkhovich等[1]利用家兔模型研究發(fā)現(xiàn)適當降低局部心肌溫度可以保護心肌免受持續(xù)缺血損傷，局部低溫的保護機制是通過維持臨界能量代謝來介導的。

低溫對線粒體也有一定保護作用，Pamenter等[2]通過小鼠大腦模型研究不同溫度對其線粒體功能的影響，結(jié)果表明低體溫可通過提高線粒體的呼吸效率從而提升缺氧大腦的能量保存和細胞活力。Huang等[3]研究發(fā)現(xiàn)低溫可減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，使線粒體細胞色素C還原酶活性提升，從而保護線粒體的完整性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)部的一種膜質(zhì)結(jié)構(gòu)，一些有害因素例如缺氧常誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致細胞凋亡，而低溫可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應阻止神經(jīng)元的凋亡[4]。

2.低溫與冷誘導RNA結(jié)合蛋白:冷誘導RNA結(jié)合蛋白(cold inducible RNA binding protein, CIRP)主要用于調(diào)控細胞的周期，通常在組織及細胞中廣泛低水平表達，低溫、紫外線、低氧等應激和炎癥條件可誘導其表達上調(diào)[5]。低溫療法已被證實對神經(jīng)損傷的患者具有神經(jīng)保護作用。CIRP和冷誘導RNA結(jié)合蛋白基序3(cold inducible RNA-binding protein motif 3, RBM3)是兩種主要的用于神經(jīng)保護的冷誘導蛋白。Rey-Funes等[6]研究報道，8℃的低溫條件可保護大鼠視網(wǎng)膜免受創(chuàng)傷性神經(jīng)病變的損害，緩解視功能損傷，他們推測起保護作用的分子機制包括兩種冷休克蛋白RBM3和CIRP的上調(diào)。

3.低溫與炎性反應：許多實驗證實，創(chuàng)傷和手術(shù)后，損傷組織激發(fā)固有免疫反應，從而引起小膠質(zhì)細胞及白細胞激活，這類激活的免疫細胞通過釋放多種因子，進一步激活炎性細胞，導致細胞死亡及免疫激活的惡性循環(huán)。參與創(chuàng)傷反應的細胞因子主要包括腫瘤壞死因子(TNF-α)，白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10等。Kimura等[7]研究證實低溫(33.5℃)抑制小膠質(zhì)細胞誘導型一氧化氮合酶和促炎性細胞因子如TNF-α和IL-1β的表達，同時低溫通過抑制小膠質(zhì)細胞活化減輕神經(jīng)元損傷。小膠質(zhì)細胞是炎癥致敏性缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain injury，HI)后炎性反應的早期關(guān)鍵介質(zhì)，在HI發(fā)生24h后，小膠質(zhì)細胞極化成主要的促炎癥表型。臨床上Bilkhu等[8]研究發(fā)現(xiàn)冷敷聯(lián)合人工淚液或是鹽酸依匹斯汀治療急性季節(jié)性過敏性結(jié)膜炎，比其他治療更能減少結(jié)膜充血，增強了藥物單獨應用的療效，可降低抗原升高的眼表溫度，是在抗原激發(fā)后1h內(nèi)將癥狀降至基線有效的治療方法。

三、低溫保存在眼庫中的應用研究

目前，器官移植在臨床中通常用來有效根治終末期器官衰竭，眼科開展移植手術(shù)革新了許多致盲眼病的治療。低溫保存是利用較低的溫度保存結(jié)構(gòu)完整的活細胞和組織，該技術(shù)目前仍作為器官移植保存方法的首選。低溫狀態(tài)下可降低離體器官的代謝，同時提升對缺血再灌注損傷的耐受性，顯著提高了移植手術(shù)的成功率[9]。

1.低溫保存與角膜移植:角膜移植手術(shù)是治療角膜病最有效的方法，而開展此類手術(shù)的基本條件就是眼庫及角膜保存技術(shù)。我國研究者曾對不同保存方法的大鼠角膜內(nèi)皮細胞進行活性染色，發(fā)現(xiàn)深低溫保存后復溫的角膜植片具有良好的內(nèi)皮活性，深低溫抑制細胞能量代謝，使其長期處于休眠狀態(tài)，經(jīng)過復溫后的細胞可恢復其正常的生物學功能[10]。角膜排斥反應是角膜移植手術(shù)失敗的主因，如何降低其發(fā)生率一直是研究的熱點。牛曉霞等[11]通過觀察大鼠穿透性角膜移植術(shù)后的角膜排斥反應指數(shù)、植片存活時間和植片的病理變化，發(fā)現(xiàn)深低溫保存組植片存活時間明顯延長，并且術(shù)后10天時HE染色顯示深低溫組炎性反應較其他組明顯減輕。

以上提及的深低溫保存對內(nèi)皮細胞密度影響的研究主要是基于動物實驗，目前臨床研究數(shù)據(jù)較少。原因是雖然深低溫保存法可明顯延長角膜保存時間、杜絕微生物對角膜的污染、同時避免自身代謝產(chǎn)物的毒性反應，但該方法存在設備昂貴、過程復雜、技術(shù)要求較高等情況，所以在國內(nèi)尚未普及。相信隨著冷凍保護劑的開發(fā)和利用,該技術(shù)將會普遍應用于國內(nèi)的醫(yī)療環(huán)境中。

姜濤等[12]用深低溫保存的角膜材料行板層角膜移植術(shù)治療邊緣性角膜變性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病例術(shù)后角膜邊緣病變均未發(fā)展，術(shù)后視力基本不受影響，尤其是術(shù)前未發(fā)生角膜穿孔的病例，術(shù)后幾乎沒有眼壓升高、瞳孔粘連、前房反應等并發(fā)癥。深低溫保存的角膜材料彌補了新鮮角膜的來源限制與時效限制，是治療邊緣性角膜變性的理想材料。

2.低溫保存與眼科其他移植手術(shù)：角膜緣干細胞(limbal stem cells，LSC)的缺乏導致進行性視力喪失，通過自體LSC移植可治療多種眼表疾病，如復發(fā)性翼狀胬肉、眼表化學損傷、角膜緣潰瘍等。鄭穗聯(lián)等[13]采用“簡化二步法”凍貯LSC，光鏡、電鏡、動物實驗均證明深低溫保存LSC結(jié)構(gòu)完整、功能良好。他們以二甲基亞砜作為冷凍保護劑，更好地保護角膜內(nèi)皮；液氮具有的超低溫性抑制細胞代謝；控速降溫避免嚴重的細胞損傷，而快速復溫可提高細胞成活率，加快其功能恢復。Osei-Bempong等[14]研究發(fā)現(xiàn)當凍存保護劑的濃度超過5%時，細胞膜的完整性、代謝和集落形成效率降低，而保護劑的種類對這些特性沒有顯著影響，這對眼庫低溫保存劑的選擇有一定指導意義。

羊膜間質(zhì)干細胞可通過分泌損傷部位的治療因子減輕角膜損傷[15]。如今保存羊膜已廣泛應用于眼科，臨床觀察其重建眼表的作用、療效及預后也與新鮮羊膜無明顯差異。魯靜等[16]曾通過觀察組織形態(tài)和細胞超微結(jié)構(gòu)，研究了4種常用的羊膜保存方法，結(jié)論是以DMEM/甘油深低溫保存法效果最好，因為深低溫冷凍保存減緩了反應和細胞死亡，并且培養(yǎng)基中所含的葡萄糖具有維持細胞滲透壓、抑制細胞水腫的作用。

Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，低溫保存的人胚胎干細胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮(human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium，hESC-RPE)細胞不僅保留了誘導的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞的特異性基因表達譜、形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，還具有極化單層、緊密連接和縫隙連接結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)顯示，即使經(jīng)過低溫保存和解凍的hESC-RPE細胞仍然可以作為治療視網(wǎng)膜變性疾病的供體細胞來源。

四、低溫治療在眼科手術(shù)中的應用研究

1.低溫與眼瞼手術(shù)：瞼緣色素痣的切除手術(shù)時常導致的并發(fā)癥有倒睫、眼瞼內(nèi)外翻甚至眼瞼畸形等，嚴重影響美觀。低溫冷凍治療色素痣通過破壞黑色素細胞，使其中斷輸送到表皮細胞，從而使色素痣脫色素。冷凍治療操作簡單、不易造成明顯眼瞼畸形及瘢痕殘留，恢復后外觀較為自然，值得推廣應用[18]。

2.低溫與角膜屈光手術(shù)：機械法-準分子激光上角膜皮瓣下磨鑲術(shù)(epipolis laser in situ keratomileusis, Epi-LASIK)是在準分子激光上皮下角膜磨鑲術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項嶄新的屈光手術(shù)技術(shù)，依舊存在術(shù)后角膜上皮下霧狀混濁(haze)等并發(fā)癥。預防角膜haze常見的方法有應用絲裂霉素(mitomycin，MMC)浸潤角膜基質(zhì)切削面、低溫平衡鹽溶液(chilled balanced salt solution，CBSS)沖洗等。沈政偉等[19]選擇Epi-LASIK作為研究術(shù)式，在術(shù)中分別應用0.2%MMC及4℃ CBSS處理基質(zhì)表面，發(fā)現(xiàn)兩組患者術(shù)后裸眼視力、殘余等效球鏡度以及上皮并發(fā)癥方面，CBSS組均稍優(yōu)于MMC組，原因可能與低溫抑制細胞凋亡、MMC的角膜上皮毒性有關(guān)，CBSS抑制Epi-LASIK術(shù)后角膜haze更有效和安全。

經(jīng)上皮準分子激光角膜切削術(shù)(trans-Epithelial photorefractive keratectomy，TPRK)存在角膜表層手術(shù)固有的術(shù)后疼痛、炎性反應明顯等問題，術(shù)中激光可使基質(zhì)床溫度升高，引起燒灼感和刺痛感，臨床上主要使用鎮(zhèn)痛藥物來抑制疼痛，這可能會延遲角膜上皮的愈合，甚至造成嚴重的角膜毒性。周友惠等[20]在術(shù)中采用4℃ CBSS沖洗結(jié)膜囊加上術(shù)后即刻冷敷術(shù)眼1h，發(fā)現(xiàn)患者手術(shù)當天疼痛評分、術(shù)后5天角膜上皮愈合及結(jié)膜充血明顯優(yōu)于常溫組，局部冷療可以抑制神經(jīng)細胞的感知能力，降低神經(jīng)末梢敏感度，可明顯減輕患者術(shù)后早期疼痛，減少止痛藥的使用。

3.低溫與白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)：白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)(phacoemulsification，Phaco)術(shù)中超聲探頭高頻振動產(chǎn)生的能量及乳化顆粒的機械損傷難免會引起角膜內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu)、數(shù)量和功能的破壞。Alzner等[21]曾監(jiān)測發(fā)現(xiàn)Phaco術(shù)中能量的釋放使房水溫度升高12℃以上，房水實時溫度高達36℃，遠超角膜所能耐受的最高溫度32℃，可直接造成角膜內(nèi)皮細胞損傷。因此，通過各種手段降低Phaco術(shù)后角膜水腫及角膜內(nèi)皮細胞的保護，長期成為研究的熱點。

低溫灌注能夠降低Phaco產(chǎn)生的熱效應，Wan等[22]對硬核白內(nèi)障的兔眼行Phaco手術(shù)，分別在術(shù)中行低溫(4℃)和常溫(24℃)灌注，術(shù)后測量角膜中央厚度和切緣厚度，檢測角膜內(nèi)皮細胞計數(shù)和觀察前房(anterior chamber，AC)炎性細胞計數(shù)，證實了低溫灌注能有效保護角膜內(nèi)皮，減輕術(shù)后角膜水腫和AC炎癥。Jiang等[23]觀察葡萄膜炎相關(guān)性白內(nèi)障患者行Phaco手術(shù)，發(fā)現(xiàn)低溫灌注組的患者術(shù)后第1天前房閃輝、房水細胞評分及角膜切口平均厚度均低于常溫組，顯示低溫灌注應用于特殊類型的白內(nèi)障同樣安全有效。證實瞬態(tài)低溫可有效預處理刺激，相關(guān)組織的代謝率降低，以此誘導機體耐受缺血性或低氧性損傷[22]。

4.低溫與抗青光眼手術(shù)：睫狀體冷凝術(shù)通過冷凍破壞睫狀體上皮和血管系統(tǒng)，同時可破壞角膜緣處神經(jīng)組織，達到減少房水生成、緩解疼痛的效果，目前主要應用于難治性青光眼的治療。曲建梅等[24]對青光眼濾過術(shù)后眼壓未被控制的患者進行睫狀體冷凝術(shù)，術(shù)后眼壓明顯下降，患者需用降眼壓藥物的數(shù)量明顯減少;術(shù)后3個月無炎性反應或疼痛。需要注意的是，睫狀體冷凝術(shù)一次手術(shù)過量可導致低眼壓及眼球萎縮，且沒有任何恢復眼壓的措施，因此選擇患者要慎重，只有在其他治療失敗或不能進行時作為一項補救措施，不能一味追求過度降低眼壓。

5.低溫與玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)：Tamai等[25]曾研究不同溫度對家兔玻璃體切除術(shù)的影響，將眼內(nèi)灌注液分別維持在9、22、37℃，術(shù)后灌洗玻璃體腔60min，分別于術(shù)前和術(shù)中監(jiān)測兔眼的溫度和葡萄膜血流，術(shù)后第1、7、14天檢測房水蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)局部低溫可以減少術(shù)中脈絡膜出血及術(shù)后早期的炎性反應。我國研究者也做過類似研究，證實局部低溫對家兔術(shù)眼血-房水屏障及血-視網(wǎng)膜屏障均有一定的保護作用。

冷凝可導致細胞死亡、組織無菌性壞死，由于這種機制，視網(wǎng)膜冷凝術(shù)可形成局部炎性反應，導致脈絡膜和視網(wǎng)膜的瘢痕黏連，從而達到封閉視網(wǎng)膜裂孔、預防視網(wǎng)膜脫離的作用[26]。視網(wǎng)膜冷凝術(shù)也可抑制因缺血缺氧而產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，從而消除視網(wǎng)膜新生血管。隨著玻璃體腔注射抗VEGF藥物的普及，抗VEGF聯(lián)合視網(wǎng)膜冷凝術(shù)可更加有效地治療如3期Coats病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)等疾病，達到消除異常血管和滲出、減輕視網(wǎng)膜脫離和預防NVG等并發(fā)癥的目的。然而，過度冷凝會造成RPE破壞以及血-視網(wǎng)膜屏障破裂，導致色素細胞較多游離、炎癥和血管生成介質(zhì)的釋放增加，易引起增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)的發(fā)生，因此應避免過度大面積冷凝。如今視網(wǎng)膜手術(shù)中多使用冷凝與激光相結(jié)合的方法，以減輕對RPE細胞的損害，阻止或減輕PVR的進展。

五、展 望

目前低溫在眼科的運用相對集中于眼庫、炎癥的控制和一些眼科手術(shù)的輔助治療。未來應更深入地探究例如低溫對神經(jīng)保護的具體治療方案、如何解決低溫可能存在的不良反應、低溫對人視網(wǎng)膜缺血或光損傷病理改變的影響等問題，需要更多實驗數(shù)據(jù)支持以及進一步的臨床觀察。