楊 浩 姜 雯 張?jiān)Ｏ?李琳琳 王蟾月 王 燁

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)腸道菌群平衡有助于人類宿主的正常代謝，而腸道菌群結(jié)構(gòu)失衡可能會導(dǎo)致多種常見代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心臟代謝疾病和營養(yǎng)不良等[1，2]。高通量多組學(xué)數(shù)據(jù)(包括宏基因組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù))的聯(lián)合分析，對腸道菌群結(jié)構(gòu)變化和其如何影響宿主代謝具有重要意義。Gou等[3]在分析2型糖尿病風(fēng)險相關(guān)的核心腸道菌群中，將有和無2型糖尿病人群糞便通過糞菌移植，分別轉(zhuǎn)接至無菌小鼠體內(nèi)，揭示了與增加2型糖尿病風(fēng)險相關(guān)的一組腸道微生物群及其特征。本課題組前期通過二代高通量測序法對糖耐量正常人群和2型糖尿病患者腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，Coriobacteiaceae菌科水平在兩組人群中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。隨后，本課題組從人群中分離并鑒定出一株來源于Coriobacteiaceae菌科的Collinsellaaerofaciens菌[5]。與Gou等[3]研究不同，筆者將Collinsellaaerofaciens菌回接至C57BL/6J小鼠體內(nèi)，初步探討單一腸道細(xì)菌對宿主血糖、血脂代謝水平的影響，從腸道菌群出發(fā)，為防治血糖血脂異常代謝提供思路。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物:從北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司購買6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠(SPF級)共40只，實(shí)驗(yàn)動物許可證：SCXK(新)2018-0002。將購買的小鼠分籠飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)間。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，即對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只。對照組小鼠予以100微升/只的0.9%NaCl注射液，其余各組予以不同劑量的菌液100微升/只，每日1次，連續(xù)灌胃12周。

2.菌液制備:目標(biāo)菌由本實(shí)驗(yàn)室從人群糞便中培養(yǎng)分離獲得，并鑒定為Collinsellaaerofaciens菌[5]。使用0.9%NaCl注射液將Collinsellaaerofaciens菌配置成低劑量、中劑量和高劑量菌液(106CFU/100μl、108CFU/100μl和1010CFU/100μl)[6]。

3.藥品與試劑:人常規(guī)胰島素(美國Lily公司，批號:C96172A)，血糖測定試劑盒(中生北控生物科技有限公司，批號:151721)，總膽固醇測定試劑盒(中生北控生物科技有限公司，批號:161941)，甘油三酯測定試劑盒(中生北控生物科技有限公司，批號:161955)，高密度脂蛋白膽固醇(南京建成生物工程研究所，批號:20180129)，低密度脂蛋白膽固醇(南京建成生物工程研究所，批號:20180130)。

4.儀器: BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，AC-S型潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，微量加樣器(芬蘭Thermo 公司，F(xiàn)innipette白色系列)，CoDa型全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-RaD公司)，MLS-3750型高壓蒸汽滅菌器(日本SANYO公司)，DNp-9082型電熱恒溫箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

5.血糖、血脂代謝水平檢測:每組小鼠于第0、4、8和12周取尾尖血，采用COD-pAp法測定血漿總膽固醇和甘油三酯水平，空腹血糖和隨機(jī)血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測。于第12周處理小鼠后，收集血漿，嚴(yán)格按照高、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒檢測各指標(biāo)。每周稱取小鼠體質(zhì)量。

6.口服糖耐量及胰島素耐量試驗(yàn):口服糖耐量實(shí)驗(yàn)：于晚10：00時撤去各組小鼠飼料，更換普通飲水，次日晨10：00時，給予每只小鼠葡萄糖溶液(2g/kg)灌胃[7]，分別于0、30、60、120min取尾尖血，采用葡萄糖氧化酶法測定小鼠各時刻血糖水平。胰島素耐量實(shí)驗(yàn)：于晚10：00時撤去各組小鼠飼料，更換普通飲水，次日晨8：00時給予每只小鼠按0.5U/kg的劑量皮下注射人常規(guī)胰島素，分別于0、40、90、120min取尾尖血，采用葡萄糖氧化酶法測定小鼠各時刻血糖水平。計(jì)算第0、4、8和12周各組小鼠OGTT和ITT曲線下面積，探討Collinsellaaerofaciens菌對小鼠血糖的影響。

結(jié) 果

1.Collinsellaaerofaciens菌對小鼠體質(zhì)量的影響:稱量各組小鼠每周體質(zhì)量，0～12周，與對照組比較，低、中和高劑量組小鼠體質(zhì)量均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 各組小鼠12周體重變化

2.空腹血糖及隨機(jī)血糖變化: 在第0、4、8和12周，與對照組比較，低、中和高劑量組小鼠空腹血糖、隨機(jī)血糖均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2、圖3)。

圖2 各組小鼠空腹血糖變化

圖3 各組小鼠隨機(jī)血糖變化

3.口服糖耐量及胰島素耐量血糖變化: 在第0、4、8和12周，與對照組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠口服糖耐量及胰島素耐量血糖曲線下面積無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4、圖5)。

圖4 各組小鼠口服糖耐量曲線下面積變化

圖5 各組小鼠胰島素糖耐量曲線下面積變化

4.總膽固醇和甘油三酯水平變化:檢測總膽固醇水平，在第0周和第4周，與對照組比較，低、中和高劑量組小鼠的總膽固醇無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在第8和12周，與對照組比較，中和高劑量組小鼠的血漿總膽固醇明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組小鼠血漿總膽固醇無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖6)。檢測甘油三酯在第0、4、8和12周，與對照組比較，低劑量組、中劑量和高劑量組小鼠的血漿甘油三酯均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖7)。

圖6 各組小鼠總膽固醇水平變化與對照組比較，*P<0.05

圖7 各組小鼠甘油三酯水平變化

5.高、低密度脂蛋白膽固醇變化:給予小鼠Collinsellaaerofaciens菌12周后，處理小鼠，收集血漿，檢測小鼠血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，與對照組比較，低和高劑量組小鼠血漿HDL-C水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖8)；中劑量組小鼠血漿HDL-C水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，低劑量組小鼠血漿LDL-C水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中和高劑量組小鼠血漿LDL-C水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖8 各組小鼠高、低密度脂蛋白膽固醇水平變化與對照組比較，*P<0.05

討 論

腸道菌群是宿主代謝的重要調(diào)節(jié)劑。2型糖尿病患者和健康人群腸道菌群有所不同，其中葡萄糖代謝受損與產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌水平降低有關(guān)[8]。腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，例如短鏈脂肪酸，氨基酸衍生物和膽汁酸等，參與代謝和免疫過程，提示腸道菌群與葡萄糖穩(wěn)態(tài)之間存在聯(lián)系[9]。本課題組前期采用16S rDNA gene實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測糖耐量正常人群及2型糖尿病患者腸道菌群，發(fā)現(xiàn)腸道菌群在糖耐量正常人群及2型糖尿病患者中存在顯著差異[10，11]。同時本課題組前期從2型糖尿病患者糞便中分離培養(yǎng)出氣單胞菌，回接至小鼠體內(nèi)8周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌可以增加小鼠體質(zhì)量，誘發(fā)小鼠糖耐量受損[12]。上述研究提示，腸道菌群與機(jī)體血糖血脂代謝存在聯(lián)系。本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上，繼續(xù)探討Collinsellaaerofaciens菌與血糖血脂代謝的關(guān)系[3]。

腸道微生物群的組成可以影響機(jī)體糖脂代謝。Lahti等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Collinsella菌屬和血清膽固醇水平呈正相關(guān)。Khan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在高膽固醇血癥患者腸道中與動脈粥樣硬化相關(guān)的Collinsella菌屬相對豐度較高。上述結(jié)果說明Collinsella菌屬可能與膽固醇變化相關(guān)。Gomez-Arango等[15]通過16S rRNA測序評估超重和肥胖孕婦糞便中微生物群，發(fā)現(xiàn)Collinsella菌屬豐度與甘油三酯和極低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)，而與高密度脂蛋白膽固醇呈負(fù)相關(guān)。本研究中將人群糞便中分離的Collinsellaaerofaciens菌回接至C57BL/6J小鼠體內(nèi)，觀察該菌對血糖血脂代謝的影響，發(fā)現(xiàn)該菌的中和高劑量可以在第8、12周明顯升高小鼠血漿總膽固醇水平。此外，該菌的中和高劑量可以明顯升高小鼠LDL-C水平，而中劑量還可明顯降低小鼠HDL-C水平。本研究結(jié)果和上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，提示Collinsellaaerofaciens菌與血脂異常代謝存在相關(guān)性[13～15]。

腸道菌群組成結(jié)構(gòu)比例變化及其代謝產(chǎn)物異常是導(dǎo)致胰島素抵抗、高胰島素血癥、血脂異常等的重要原因之一[16]。腸道菌群結(jié)構(gòu)的失衡可能通過以下幾個作用機(jī)制影響心血管疾病，包括：①腸道細(xì)菌內(nèi)毒素移位，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放而導(dǎo)致炎性反應(yīng)；②腸道菌群結(jié)構(gòu)的失衡誘發(fā)物質(zhì)代謝異常，如脂質(zhì)和色氨酸代謝等；③腸道菌群結(jié)構(gòu)的失衡加劇機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。腸道微生物中革蘭陰性條件致病菌數(shù)量增多，可顯著增加內(nèi)毒素脂多糖(LPS)水平，降低腸緊密連接蛋白 1和封閉蛋白的表達(dá)，破壞腸黏膜屏障功能，導(dǎo)致細(xì)菌移位，產(chǎn)生大量 LPS 到血液中，引發(fā)炎性反應(yīng)[18]。Baskar 等[19]在研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)菌與腸黏膜屏障的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，Collinsellaaerofaciens菌與腸黏膜屏障通透性增加密切相關(guān)。穩(wěn)定的腸黏膜屏障可延緩或抑制心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。除了血脂異常外，炎性反應(yīng)可能也是導(dǎo)致動脈粥樣血管硬化等心血管疾病的重要因素。膽固醇、脂肪酸和修飾的脂質(zhì)可以直接激活炎癥途徑。反之亦然，促炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(即細(xì)胞因子)直接影響脂質(zhì)代謝[20]。另有文獻(xiàn)報(bào)道Collinsellaaerofaciens菌參與促炎性免疫反應(yīng)，誘發(fā)機(jī)體炎癥[21]。因此，本研究推測Collinsellaaerofaciens菌引發(fā)小鼠血脂代謝異常可能與其引發(fā)宿主腸黏膜屏障破壞，誘發(fā)炎性反應(yīng)有關(guān)。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)不同劑量的Collinsellaaerofaciens菌在誘發(fā)小鼠血脂代謝異常變化中不成劑量依賴性，其中中劑量菌在引發(fā)小鼠HDL-C水平降低較高劑量明顯。Udayappan等[6]在給予db/db小鼠口服Eubacteriumhallii菌改善胰島素敏感度研究中，發(fā)現(xiàn)Eubacteriumhallii菌也不呈劑量依賴性，其中與較低劑量比較，高劑量改善胰島素敏感度的影響較小，并推測其可能與這些高濃度細(xì)菌菌株(>1010CFU)在腸道中引起擁擠效應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)從人糞便中分離的Collinsellaaerofaciens菌可誘發(fā)小鼠血脂代謝異常，初步論證腸道微生物與血脂代謝的關(guān)系，為血脂代謝異常的研究及新藥開發(fā)提供思路。