譚仕廉 李艷麗 何永勛 郭 樂 申元英

炎性反應(yīng)是生物組織在應(yīng)對外界刺激時所發(fā)生的一種非常重要的防御反應(yīng)，它可以限制炎癥擴散、清除壞死組織、恢復(fù)器官功能。然而炎癥也是一把“雙刃劍”，當(dāng)炎性反應(yīng)變得不可控時，會引起細胞發(fā)生嚴重的變性和壞死，影響受累組織和器官的功能，還會引起增生性反應(yīng)，有潛在的致癌風(fēng)險[1]。巨噬細胞作為固有免疫細胞，其表面表達多種模式識別受體、趨化/活化相關(guān)細胞因子受體，具有很強的識別吞噬和殺傷清除病原體能力，同時作為專職抗原遞呈細胞，還具有攝取、加工遞呈抗原引發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力，因此是最早對機體穩(wěn)態(tài)紊亂做出反應(yīng)的細胞之一，在機體炎癥中起到非常重要的調(diào)控作用[2]。

microRNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達，以控制細胞分化、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，細胞外miRNAs還可在各種生理和病理過程中介導(dǎo)細胞間的通信[3]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，miRNAs在炎性反應(yīng)中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[4, 5]。miR-155已被證實通過多種方式參與調(diào)控炎性反應(yīng)，作為一個重要的“親炎癥”miRNAs備受關(guān)注[6,7]。本實驗使用LPS處理THP-1巨噬細胞構(gòu)建細胞炎性模型，檢測miR-155對炎性細胞因子及相關(guān)基因表達的影響，探討miR-155在THP-1巨噬細胞炎性反應(yīng)中的作用及其機制，為miR-155調(diào)控炎性反應(yīng)增添新的認識。

材料與方法

1.細胞系和主要試劑：人單核細胞THP-1(TCHu 57)由中國科學(xué)院上海細胞庫提供。胎牛血清購自美國Gibco公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司。佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA) 購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。LPS(055:B5)購自愛必信(上海)生物科技有限公司。總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒均購自諾唯贊公司。miRNA外參、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體購自美國Thermo Fisher Scientific公司。miR-155 mimics序列上游引物：5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUU-3′，下游引物：5′-CCCCUAUCACGAUUAGCAUUAAUU-3′；mimics NC序列上游引物：5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′，下游引物：5′-GUACUUUUGUGUAGUACAAUU-3′，均設(shè)計合成于上海生工生物公司。TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購自四正柏生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。10×電轉(zhuǎn)液、5×Tris電泳液和彩色預(yù)染蛋白均購自北京索萊寶科技有限公司。β-actin一抗、STAT3一抗、p-STAT3一抗、羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。

2.THP-1細胞培養(yǎng)和分化：THP-1單核細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%雙抗、1%非必需氨基酸的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)；在細胞處于對數(shù)生長期且狀態(tài)良好時加入濃度為100ng/ml的PMA誘導(dǎo)48h，THP-1單核細胞逐漸由懸浮的體積較小、透亮的圓形細胞變?yōu)橘N壁的體積較大、中心較暗的圓形或橢圓形細胞，且形狀不規(guī)則，少數(shù)細胞伸出偽足成為梭型，呈現(xiàn)巨噬細胞形態(tài)，表明細胞已誘導(dǎo)分化為THP-1巨噬細胞。

3.毒性試驗：用CCK-8法檢測LPS對THP-1巨噬細胞活力的影響。在96孔板中加入1×104個THP-1細胞，經(jīng)PMA誘導(dǎo)48h后，再與不同濃度(1、10、100、1000、10000ng/ml)的LPS孵育24h。按體積比1∶10混合CCK-8溶液和1640培養(yǎng)基，每孔加入100μl，37℃培養(yǎng)4h，用全自動多功能酶標儀在波長450nm處測定吸光度(A)值。

4.細胞轉(zhuǎn)染：按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將Lipofectamine2000 脂質(zhì)體與miRNA-155 mimics或mimics NC以體積比1∶50均勻混合，冰上靜置融合20min后緩慢加入到已分化的THP-1巨噬細胞中，搖晃均勻培養(yǎng)6h，更換為1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48h后進行后續(xù)實驗。

5.總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR(RT-qPCR)：采用 TRIzol 法提取各組THP-1巨噬細胞總RNA后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用RT-qPCR試劑盒擴增上述cDNA并分析其對應(yīng)的mRNA表達。引物均由上海生工生物公司合成，主要基因引物序列詳見表1。

表1 主要基因的引物序列

6.ELISA法檢測細胞上清中炎性細胞因子的含量：收集各組THP-1巨噬細胞上清，按照TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒操作步驟，檢測細胞上清在450nm處的A值，根據(jù)吸光值繪制標準曲線，分別計算出細胞上清中TNF-α、IL-1β的含量。

7.Western blot法分析蛋白表達：將2×106個/孔接種于6孔細胞板，分組為control組(對照組)、LPS組、miR-155 mimics+LPS組、miR-155 mimics 組、mimics NC+LPS組、mimics NC 組。RIPA裂解細胞以提取總蛋白，經(jīng)BCA蛋白定量檢測試劑盒進行定量。取含 20μg 蛋白的裂解液，經(jīng)12.5% SDS-PAGE 120V電泳2h，再轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以5%脫脂奶粉封閉1h后用PBS漂洗3次，每次5min，加入特異性一抗于4℃冰箱孵育過夜。次日 PBST 漂洗3次，每次5min，加入二抗室溫孵育1h后，再用PBST漂洗3次，每次5min，經(jīng)ECL曝光成像。

結(jié) 果

1.LPS對THP-1巨噬細胞的毒性作用:使用不同濃度(1、10、100、1000、10000ng/ml)的LPS處理已分化的THP-1巨噬細胞24h，CCK-8法檢測細胞活性。LPS處理后的細胞活力與未處理細胞比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)，說明實驗所用LPS最大濃度(10000ng/ml)對THP-1巨噬細胞無毒性作用。

圖1 LPS對THP-1巨噬細胞的毒性作用

2.LPS上調(diào)THP-1巨噬細胞中miR-155的表達：RT-qPCR結(jié)果顯示，不同濃度LPS處理1.5h后均上調(diào)了THP-1巨噬細胞中miR-155的表達，且呈濃度依賴性，在處理時表達最高(P<0.001，圖2)。后續(xù)使用濃度為100ng/ml的LPS，探究miR-155在調(diào)控巨噬細胞炎癥中發(fā)揮的作用。

圖2 不同濃度LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞miR-155的表達

3.轉(zhuǎn)染miR-155 mimics明顯促進THP-1巨噬細胞中miR-155的表達：RT-qPCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics后THP-1巨噬細胞中miR-155表達顯著上調(diào)(P<0.001，圖3)，成功構(gòu)建過表達miR-155細胞系。

圖3 構(gòu)建miR-155過表達的THP-1巨噬細胞

4.過表達miR-155促進LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞中TNF-α和IL-1β表達：RT-qPCR結(jié)果顯示，100ng/ml LPS處理1.5h顯著上調(diào)了THP-1巨噬細胞中TNF-α和IL-1β mRNA的表達(P<0.001，圖4中A和B)，過表達miR-155促進了LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β mRNA的表達(P<0.001，圖4中A和B)；ELISA結(jié)果顯示，100ng/ml LPS處理1.5h后，THP-1巨噬細胞上清中TNF-α和IL-1β分泌增加(P<0.001，圖4中C和D)，過表達miR-155進一步增加了LPS誘導(dǎo)的TNF-α和IL-1β分泌(P<0.001，圖4中C和D)。分泌水平和mRNA水平結(jié)果一致。

圖4 過表達miR-155對THP-1巨噬細胞炎性細胞因子表達的影響A.miR-155對THP-1巨噬細胞中TNF-α mRNA表達的影響；B.miR-155對THP-1巨噬細胞中IL-1β mRNA表達的影響；C.miR-155對THP-1巨噬細胞上清中TNF-α分泌的影響；D.miR-155對THP-1巨噬細胞上清中IL-1β分泌的影響

圖5 miR-155對JAK/STAT3信號通路蛋白的影響A.miR-155對THP-1巨噬細胞中STAT3 mRNA表達的影響；B.miR-155對THP-1巨噬細胞中STAT3蛋白和p-STAT3蛋白表達的影響

5.過表達miR-155對LPS誘導(dǎo)的JAK/STAT3信號通路蛋白的影響：RT-qPCR結(jié)果顯示，LPS上調(diào)THP-1巨噬細胞中STAT3 mRNA水平表達(P<0.05)，過表達miR-155后進一步增加了STAT3 mRNA水平的表達(P<0.01，圖5A)；Western blot法分析顯示，LPS升高THP-1巨噬細胞中JAK/STAT3信號通路蛋白p-STAT3蛋白表達，過表達miR-155后也進一步增加p-STAT3蛋白表達(圖5B)。蛋白水平結(jié)果與基因水平結(jié)果一致。

討 論

大量證據(jù)表明炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展與miRNAs的失調(diào)緊密相關(guān)。有研究者分析發(fā)現(xiàn)炎性結(jié)腸組織中存在多種miRNAs異常表達，例如miR-21、miR-30b、miR-34c-5p、miR-146a、miR-155、miR-196a等表達增加，是炎性反應(yīng)和纖維化過程中重要的調(diào)節(jié)因子，有望作為克羅恩病的生物學(xué)標志物[8]。Pathak等[9]研究揭示miR-155在潰瘍性結(jié)腸炎患者的肌成纖維細胞(intestinal myelofibrosis, IMF)中顯著上調(diào)，通過靶向抑制SOCS-1蛋白的表達，激活I(lǐng)MF炎癥表型，增加IL-6和IL-8的釋放，從而加重了患者腸道炎性反應(yīng)。孫廣等[10]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體中表達上調(diào)，并且與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)生和嚴重程度有關(guān)。

巨噬細胞存在于所有組織中，幾乎參與調(diào)控機體生物學(xué)的各個方面，從發(fā)育、穩(wěn)態(tài)到組織修復(fù)，以及作為免疫細胞在調(diào)節(jié)免疫、炎性反應(yīng)中也發(fā)揮核心作用[11]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，激活表型多樣性是巨噬細胞生物學(xué)中與疾病評估最密切相關(guān)的指標，可用于預(yù)測疾病的炎癥狀態(tài)以及癌癥的生存率[12]。另外有研究顯示，動脈粥樣硬化中炎癥的主要解決辦法是使炎癥性巨噬細胞的表型轉(zhuǎn)化為抑制炎癥和促進愈合的巨噬細胞，突出了維持巨噬細胞穩(wěn)態(tài)在炎癥性疾病防治中的重要性[13]。一項基于miRNAs調(diào)控巨噬細胞炎性反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-155和miR-146a能夠嚴格調(diào)節(jié)巨噬細胞炎性反應(yīng)的“開啟”和“關(guān)閉”，miR-155表達升高導(dǎo)致了miR-146a缺陷小鼠出現(xiàn)過度的炎性反應(yīng)，從而強調(diào)了miR-155在促進巨噬細胞炎癥中的主導(dǎo)功能[14]。本研究結(jié)果同樣證實，miR-155 在LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞炎性反應(yīng)中表達上調(diào)，通過影響相關(guān)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)及炎性細胞因子的表達，促進了THP-1巨噬細胞的炎性反應(yīng)。

研究表明促炎性細胞因子如TNF-α、IL-1β在許多炎癥性疾病的發(fā)病機制及疾病進展中起重要的推動作用[15, 16]，同時與體內(nèi)外炎癥和巨噬細胞活化的嚴重程度緊密相關(guān)[17]。實驗者發(fā)現(xiàn)miR-155轉(zhuǎn)基因小鼠在暴露于LPS時產(chǎn)生更高水平的TNF-α，推測miR-155很可能是直接靶向參與調(diào)控LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的mRNA表達，如fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域蛋白、IκB激酶ε、和受體相互作用的絲氨酸-蘇氨酸激酶1，同時增強TNF-α的翻譯[18]。在本研究中，TNF-α、IL-1β的表達量指示LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞中炎癥的嚴重程度。通過RT-qPCR和ELISA兩種方法測定miR-155對TNF-α、IL-1β表達的影響，實驗結(jié)果表明miR-155在基因水平和蛋白水平上均表現(xiàn)出對TNF-α、IL-1β產(chǎn)生的促進作用(圖4)。

JAK/STAT信號通路是多種細胞因子和生長因子在細胞內(nèi)傳遞信號的共同途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及炎癥等多種生理過程[19]。研究已證實JAK/STAT信號通路失調(diào)可導(dǎo)致多種炎性反應(yīng)的發(fā)生[20]。p-STAT3 作為炎性反應(yīng)的響應(yīng)因子之一，是STAT3與受體結(jié)合后實現(xiàn)其磷酸化活化，然后形成同/異二聚體并入核，與相應(yīng)的靶基因啟動子結(jié)合而激活相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄和表達[21～23]。在本實驗中，miR-155 在LPS誘導(dǎo)THP-1巨噬細胞中可以有效促進轉(zhuǎn)錄因子STAT3的磷酸化活化，進而調(diào)控JAK/STAT3信號通路發(fā)揮促炎作用。

綜上所述，miR-155促進LPS誘導(dǎo)的THP-1巨噬細胞炎性反應(yīng)，其機制與引起p-STAT3磷酸化，促進JAK/STAT3信號通路激活，導(dǎo)致炎性細胞因子TNF-α和IL-1β高表達有關(guān)。本研究證明了miR-155的促炎作用，為miR-155在巨噬細胞炎癥網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用增添新的認識，給靶向巨噬細胞炎癥以防治炎癥性疾病提供了新的視角，miRNA治療也有望開啟炎癥治療的新時代。