陳志軒，華 奕，陳學(xué)紅，文 浩，孫會剛

（徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇徐州 221018）

植物中抑菌物質(zhì)種類研究和應(yīng)用是當(dāng)代研究熱點(diǎn)之一，許多專家和學(xué)者對植物的抑菌效果進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)具有有效抑菌活性的植物可達(dá)1 400種[1-2]。其中，具有一定抑菌作用效果的次級代謝產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到了40多萬種，這些次級代謝產(chǎn)物大致可分為黃酮類、生物堿類、多炔族類、有機(jī)酸類、酚類、甙族、木脂素和香豆素等[3]。

苔干有很高的營養(yǎng)和保健價(jià)值。張雪香等[4]分析測定了苔干中含有大量糖類、酚類、生物堿及黃酮類物質(zhì)。甄清等[5]對苔干抗菌作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，得出苔干85 ℃的醇提取液具有抑菌性質(zhì)，結(jié)果分析苔干的醇提取液中含黃酮類物質(zhì)。甄清等[6]利用苔干的丙酮、乙酸乙酯提取液進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)苔干提取液對短帚霉菌、犬小孢子菌等各類菌種都可能具有一定的抑制效果，竹筍也具有良好的抑菌作用。高雪娟等[7]用竹筍殼提取物進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，提取物對于根霉、黑曲霉、釀酒酵母這3種天然真菌沒有明顯的抑制作用，但是對于大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草黃芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌等菌種具有顯著的抑制效果。彭昕等[8]對雷竹筍總甾醇和總黃酮的抑菌活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)雷竹筍有機(jī)溶劑提取物對黑曲霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等都具有良好的抑制作用，其對細(xì)菌抑制效果大于真菌，對革蘭氏陽性菌抑制效果大于革蘭氏陰性菌，并且總黃酮的抑菌效果通常比總甾醇的抑菌效果要更好。本文對提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和復(fù)配比例等一系列參數(shù)進(jìn)行單因素抑菌實(shí)驗(yàn)，探究苔干和竹筍的乙醇提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物

苔干，購于安徽亳州；竹筍，購于四川樂山。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基：蒸餾水400 mL，瓊脂8 g，氯化鈉（NaCl）4 g，酵母提取物2 g，胰蛋白胨4 g，pH為7.4～7.6。肉湯瓊脂固體培養(yǎng)基：蒸餾水400 mL，瓊脂7.2 g，氯化鈉（NaCl）6 g，胰蛋白胨4 g，牛肉膏6 g。葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：蒸餾水400 mL，瓊脂8 g，氯化鈉（NaCl）2 g，胰蛋白胨6 g，葡萄糖8 g，牛肉膏0.2 g。

1.1.3 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），徐州工程學(xué)院；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），徐州工程學(xué)院；大腸桿菌（Escherichia coli），徐州工程學(xué)院；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），徐州工程學(xué)院。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2140N電子天平，上海精密科學(xué)儀器；YP402N電子天平，上海精密科學(xué)儀器；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology；循環(huán)水真空泵，上海啟前電子科技；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器；烘箱，上海群基實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)；GS-700高速多功能粉碎機(jī)，永康市天祺盛世工貿(mào)；BCD-539WT電冰箱，青島海爾；BCD-212KA電冰箱，青島海爾；恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療機(jī)械。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取液的制備

以乙醇為溶劑，用超聲波輔助提取法[9]提取。精確稱量總量10 g的苔干與竹筍粉末，分別按不同質(zhì)量比（7∶3、5∶5、3∶7）混合置于燒瓶中，分別倒入100 mL 50%的乙醇溶液，攪拌。調(diào)整超聲波清洗機(jī)參數(shù)至55 ℃、60 min。室溫靜置、抽濾濃縮，旋蒸至10 mL，制成1 g/mL的原液備用。

1.3.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

將4種菌液分別稀釋至10-3與10-4兩個(gè)梯度待用。用移液槍分別吸取100 μL的10-3和10-4兩個(gè)梯度菌液于合適的培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻并做好標(biāo)記。采用打孔法[10]在培養(yǎng)基上打好孔，將提取出來的抗菌活性物質(zhì)注射適量到孔內(nèi)。蓋上蓋子，將平板置于36.8 ℃的恒溫恒濕箱中，培養(yǎng)17 h后用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈大小。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

在提取過程中影響苔干和竹筍提取抗菌活性物質(zhì)的主要參數(shù)有4個(gè)：復(fù)配比例、提取時(shí)間、提取溫度以及乙醇濃度。本實(shí)驗(yàn)對每項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行3個(gè)水平的單因素實(shí)驗(yàn)，提取時(shí)間：30 min、60 min、90 min；提取溫度：45 ℃、55 ℃、65 ℃；乙醇濃度：30%、50%、70%，并 分別用7∶3、5∶5、3∶7這3個(gè)復(fù)配比例來對每個(gè)參數(shù)進(jìn)行重新提取，再測量其抑菌圈大小。每種方法測定兩種（10-3和10-4）菌液濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)

當(dāng)乙醇濃度為50%、提取溫度為55 ℃、提取時(shí)間為60 min時(shí)，苔干與竹筍的提取液及其復(fù)配液對10-3與10-4兩濃度的4種菌均有不同程度抑制效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取液抑菌效果

2.2 不同提取條件的抑菌效果

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4種指示菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，以大腸桿菌為例得出的最佳提取條件，如表1和表2所示（表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值）。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取時(shí)間為60 min，乙醇濃度為50%時(shí)，提取溫度65 ℃效果最好，在上述最優(yōu)提取條件下，7∶3這個(gè)復(fù)配比例效果最好。

表1 不同提取條件對大腸桿菌的抑菌效果

表2 最優(yōu)條件下不同復(fù)配比例對大腸桿菌的抑菌效果

2.3 復(fù)配比例對不同微生物的抑菌效果

由表3可知，在最優(yōu)提取條件下（提取時(shí)間60 min、提取溫度65 ℃、乙醇濃度50%），苔干占比越高，抑菌效果越好，即最佳復(fù)配比均為7∶3。

表3 復(fù)配比例對不同微生物的抑菌效果（單位：mm）

3 結(jié)論

本研究以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及蠟樣芽孢桿菌為指示菌，通過一系列單因素抑菌實(shí)驗(yàn)得到，乙醇作為提取溶劑時(shí)，苔干蘆筍最佳提取條件為提取時(shí)間60 min、提取溫度65 ℃以及乙醇濃度50%。在此條件下又進(jìn)一步以復(fù)配比為變量，發(fā)現(xiàn)苔干竹筍復(fù)配比為7∶3時(shí)對4種菌抑制效果最好。