朱琳琳 張明明 郭格格 徐祉軒

中圖分類號 R965;R735.7 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）09-1082-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.09.10

摘 要 目的 研究藍萼甲素（GLA）對人肝癌HCCLM3細胞自噬與凋亡的調節(jié)作用機制。方法 HCCLM3細胞按不同實驗目的主要設對照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組。對照組僅加入完全培養(yǎng)基，各給藥組分別加入含GLA相應終質量濃度的完全培養(yǎng)基。采用流式細胞術檢測細胞周期分布與凋亡情況;采用透射電鏡觀察細胞線粒體形態(tài)和自噬情況（僅設對照組、GLA 5 μg/mL組）;采用JC-1染色和熒光倒置顯微鏡觀察并檢測細胞線粒體膜電位;采用Western blot法檢測細胞中Bcl-2、Bax、Beclin1、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）蛋白的表達;采用免疫共沉淀法檢測細胞中Bcl-2與Beclin1的結合與解離（僅設GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組）。結果 與對照組相比，GLA 5、10 μg/mL能夠誘發(fā)細胞周期顯著阻滯于G2～M期、誘導線粒體膜電位顯著下降、增加促凋亡作用，還能顯著促進Bax、cleaved caspase-3、Beclin1蛋白表達，顯著抑制Bcl-2蛋白表達（P<0.01）;GLA 5 μg/mL還可引發(fā)線粒體形態(tài)顯著改變，自噬小體增多。免疫共沉淀法結果顯示，與GLA 5 μg/mL比較，GLA 10 μg/mL能夠增強Bcl-2與Beclin1的結合。結論 GLA可能通過Bcl-2/Beclin1靶點調節(jié)HCCLM3細胞自噬與凋亡，且作用效果與劑量密切相關。

關鍵詞 藍萼甲素;靶點;機制;自噬;凋亡;Bcl-2;Beclin1

Study on regulation mechanism of glaucocalyxin A on the autophagy and apoptosis of HCCLM3 hepatocellular carcinoma cells through Bcl-2/Beclin1 target

ZHU Linlin，ZHANG Mingming，GUO Gege，XU Zhixuan（School of Laboratory Medicine， Xinxiang Medical University/Henan Collaborative Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine/Henan Key Laboratory of Immunology and Targeted Therapy， Henan Xinxiang 453003， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE To study the regulatory mechanism of glaucocalyxin A （GLA） on autophagy and apoptosis of HCCLM3 hepatocellular carcinoma cells. METHODS HCCLM3 cells were taken， and control group， GLA 2.5 μg/mL group， GLA 5 μg/mL group and GLA 10 μg/mL group were mainly set according to different experimental purposes. In control group， only complete medium was added; in each administration group， complete medium containing the corresponding final concentration of GLA was added. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry; mitochondrial morphology and autophagy were observed by transmission electron microscope （only control group， GLA 5 μg/mL group）; JC-1 staining and fluorescence inverted microscope were used to observe and detect the mitochondrial membrane potential of the cells; Western blot assay was used to detect the protein expression of Bcl-2， Bax， Beclin1 and cleaved caspase-3 proteins in the cells; the co-immunoprecipitation method was used to detect the binding and dissociation of Bcl-2 and Beclin1 （only GLA 5 μg/mL group， GLA 10 μg/mL group）. RESULTS Compared with control group， GLA 5 μg/mL and GLA 10 μg/mL could induce a significant arrest of the cell cycle in the G2-M phase for HCCLM3， a significant decrease in mitochondrial membrane potential， an increase in apoptosis as well as significant promotion of the protein expression of Bax， cleaved caspase-3 and Beclin1， and significant inhibition of the protein expression of Bcl-2 （P<0.01）. GLA 5 μg/mL also significantly changed mitochondrial morphology and increased autophagosomes. The results of co-immunoprecipitation showed that compared with GLA 5 μg/mL， GLA 10 μg/mL could enhance the binding of Bcl-2 and Beclin1. CONCLUSIONS GLA can regulate the autophagy and apoptosis of HCCLM3 cells by Bcl-2/Beclin1 target. The effect is closely related to the dose of GLA.

KEYWORDS ? glaucocalyxin A; target; mechanism; autophagy; apoptosis; Bcl-2; Beclin1

細胞自噬與凋亡存在諸多聯(lián)系，與一系列基因激活、表達調控相關。正常情況下，兩者處于平衡狀態(tài);藥物、環(huán)境可以打破二者平衡，引發(fā)細胞走向不同結局，從而促進或抑制腫瘤發(fā)展。藍萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是從中草藥香茶菜中分離提取的活性成分?；A研究表明，其具有良好的抗腫瘤作用，能夠通過線粒體活性氧調節(jié)腫瘤細胞自噬，也可通過線粒體Bcl-2相關信號通路引起細胞周期阻滯并誘發(fā)細胞凋亡[1-5]?？梢?，GLA調節(jié)細胞自噬、凋亡均與線粒體密切相關。

研究證實，Bcl-2通過與自噬相關蛋白Beclin1結合可抑制細胞自噬，兩者解離則促進細胞自噬、抑制細胞凋亡，Bcl-2/Beclin1復合體對細胞自噬與凋亡轉歸具有重要的調節(jié)作用[6]。筆者團隊前期研究顯示，GLA對Bcl-2相關信號通路的表達具有雙向調節(jié)作用[7]。若能闡明GLA在細胞自噬與凋亡過程中的作用靶點，有效利用GLA調節(jié)細胞自噬與凋亡轉歸，對臨床抗腫瘤治療具有重要意義。肝癌是常見的惡性腫瘤，也是臨床治療效果欠佳的腫瘤，亟需尋找療效好、不良反應小的藥物。因此，本研究以人肝癌HCCLM3細胞系為載體，以線粒體信號通路中參與調節(jié)細胞自噬與凋亡平衡的Bcl-2/Beclin1復合體為靶點，探討GLA調節(jié)細胞自噬與凋亡轉歸的作用機制及靶點，為深入研究GLA的抗腫瘤作用機制、開發(fā)臨床抗腫瘤新藥提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

371型CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scien- tific公司;1658033型電泳儀購自美國Bio-Rad公司;5804R型臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司;FACS Carlibur型流式細胞儀購自美國BD公司;Axio Vert.A1型熒光倒置顯微鏡購自德國Zeiss公司;HT 7800型透射電鏡購自日本Hitachi公司;Azure 600型化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Azure公司。

1.2 藥物與試劑

GLA由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院提供，純度為99.8%（高效液相色譜法）。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖液、L-谷氨酰胺、青鏈霉素混合液（批號分別為D8371、P1020、G0200、P1400）購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（批號分別為P0012、C1052、C2006）購自上海碧云天生物技術有限公司;細胞凋亡檢測試劑盒（批號abs50001）購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司;兔源性Bax抗體、Bcl-2抗體、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）抗體、Beclin1抗體（批號分別為ab32503、ab32124、ab32042、ab210498）購自英國Abcam公司;鼠源性β-肌動蛋白（β-actin）抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗與山羊抗鼠IgG二抗（批號分別為3700S、7074S、7076S）購自美國CST公司;電鏡固定液（批號G1102）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 細胞

人肝癌HCCLM3細胞系由中國科學院上海細胞庫提供。

2 方法

2.1 GLA母液配制

取500 μg GLA溶于50 μL二甲基亞砜中，制備成質量濃度為10 mg/mL的母液，分裝保存于-20 ℃冰箱，使用時用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至不同濃度。

2.2 細胞培養(yǎng)與分組

HCCLM3細胞在含10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期的HCCLM3細胞進行后續(xù)實驗。根據(jù)研究目的，細胞周期、線粒體膜電位、細胞凋亡、細胞自噬與凋亡相關蛋白表達水平檢測設對照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組;細胞自噬病理觀察設對照組、GLA 5 μg/mL組;Bcl-2與Beclin1的結合與解離實驗設GLA 5 μg/mL組、GLA 10 ? μg/mL組。對照組僅加入完全培養(yǎng)基;GLA各給藥組根據(jù)前期預實驗結果并參考文獻[7]，分別加入含相應終質量濃度GLA的完全培養(yǎng)基。

2.3 細胞周期檢測

采用流式細胞術檢測。將對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于6孔板，每孔含1×106個細胞，每組設3個復孔。將細胞按照“2.2”項下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，按細胞周期檢測試劑盒操作說明書收集、固定細胞，染色，上機分析細胞周期分布。利用Flow Jo軟件分析G0、G1、G2、S、M期細胞占比。

2.4 線粒體膜電位檢測

采用JC-1染色和熒光倒置顯微鏡觀察并檢測。將對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于12孔板中，每孔含5×105個細胞，每組設3個復孔。將細胞按照“2.2”項下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細胞。采用JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒檢測細胞中紅綠熒光并拍照。紅綠熒光強度的比值提示線粒體膜電位的變化：當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集產生紅色熒光;當線粒體膜電位下降時，JC-1主要為單體，產生綠色熒光。

2.5 細胞自噬病理觀察

采用透射電鏡觀察。將對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，每皿含5×106個細胞，每組設3個復皿。將細胞按照“2.2”項下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細胞。以磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸細胞，并轉移至1 mL尖底離心管，以1 000 r/min離心5 min，吸棄磷酸鹽緩沖液，加10倍體積電鏡固定液固定細胞，觀察細胞線粒體形態(tài)和自噬情況，并拍照。

2.6 細胞凋亡檢測

采用流式細胞術檢測。將對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于6孔板中，每孔含1×106個細胞，每組設3個復孔。將細胞按照“2.2”項下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細胞，以預冷磷酸鹽緩沖液洗滌后重懸細胞，采用細胞凋亡檢測試劑盒中的Annexin Ⅴ-FITC 標記，避光、室溫孵育15 min，以PI染色后上機檢測細胞凋亡率。

2.7 細胞中自噬與凋亡相關蛋白表達水平檢測

采用Western blot法檢測。將對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于6孔板中，每孔含1×106個細胞，每組設3個復孔。將細胞按照“2.2”項下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，提取細胞總蛋白并以BCA法測定蛋白濃度后，取蛋白適量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后依次轉膜，封閉，加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Beclin1、β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃搖床孵育過夜;加入辣根過氧化物酶標記的二抗（稀釋度為1 ∶ 3 000），室溫搖床孵育1 h;洗膜后曝光，在化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像、掃描。以目的蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 細胞中Bcl-2與Beclin1的結合與解離狀態(tài)檢測

采用免疫共沉淀法檢測。將對數(shù)生長期的HCCLM3細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，每皿含5×106個細胞，每組設3個復皿。按照“2.2”項下方法分組并給藥，培養(yǎng)24 h，收集細胞，提取細胞總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。取2組蛋白樣品分裝于IgG陰性對照管、檢測管中。IgG陰性對照管中加入IgG抗體，用于消除非特異性蛋白的影響，作為陰性對照;檢測管中加入Bcl-2抗體，用于收集與Bcl-2結合的Beclin1蛋白。將上述陰性對照管和檢測管于4 ℃搖床孵育過夜，每管加入瓊脂糖凝珠，篩選出與Bcl-2結合的Beclin1蛋白，變性處理后以Western blot法檢測Bcl-2與Beclin1結合的蛋白表達情況。

2.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 GLA對HCCLM3細胞周期阻滯的影響

流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較，GLA 5 ? ?μg/mL組、GLA 10 μg/mL組HCCLM3細胞周期顯著阻滯于G2～M期，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），尤以GLA 10 μg/mL組作用更為明顯;而GLA 2.5 μg/mL組的細胞周期阻滯作用差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見圖1、表1。

3.2 GLA對HCCLM3細胞線粒體膜電位的影響

細胞線粒體膜電位結果顯示，對照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組細胞中紅綠熒光強度比值分別為1.712±0.335、1.673±0.297、0.541±0.134、0.117±0.041。與對照組比較，GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組細胞紅綠熒光強度比值降低，提示線粒體膜電位降低，尤以GLA 10 μg/mL組下降更為顯著（P<0.01）。結果見圖2。

3.3 GLA對HCCLM3細胞線粒體形態(tài)和自噬的影響

透射電鏡觀察結果顯示，GLA 5 μg/mL組細胞線粒體高度腫脹，嵴模糊不清甚至消失，出現(xiàn)較多自噬小體;對照組細胞線粒體形態(tài)無異常。結果見圖3。

3.4 GLA對HCCLM3細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示，對照組、GLA 2.5 μg/mL組、GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組的細胞凋亡率分別為（3.277±0.415）%、（4.087±0.945）%、（17.625±1.433）%、（74.673±3.402）%。與對照組比較，GLA 2.5 μg/mL組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組均顯示出顯著的促凋亡作用（P<0.01），且GLA 10 μg/mL組促凋亡作用更明顯。結果見圖4。

3.5 GLA對HCCLM3細胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Beclin1蛋白表達的影響

Western blot法檢測結果顯示，GLA 5 μg/mL組、GLA 10 μg/mL組HCCLM3細胞中Bax、cleaved caspase-3、 Beclin1蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（P<0.01）。結果見圖5。

3.6 GLA對HCCLM3細胞中Bcl-2與Beclin1結合與解離的影響

免疫共沉淀法檢測結果見圖6，圖中Bcl-2列、Beclin1行上的條帶代表與Bcl-2結合的Beclin1的量。圖6B中的條帶比圖6A中條帶明顯，說明GLA 10 μg/mL組Beclin1與Bcl-2的結合較多。IgG列為陰性對照，Input列為陽性對照，兩組之間均無明顯差異。由此可見，與GLA 5 μg/mL組比較，GLA 10 μg/mL組HCCLM3細胞中Bcl-2與Beclin1的結合增強。

4 討論

細胞周期是細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期（G1、S、G2期）與分裂期（M期）：G2期是DNA復制結束與有絲分裂開始之間的間隙，為進入M期提供物質條件;G2～M期是細胞處于復雜活躍的分子水平變化時期，容易受外界條件的影響;而G0期是具有分裂能力但暫時未進入細胞周期的細胞。如果能夠人為調控細胞周期，對深入認識腫瘤的發(fā)生及研究抗腫瘤藥物的作用機制具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，GLA能夠誘發(fā)膀胱癌細胞周期阻滯[4]。本研究結果進一步證實，GLA 5、10 μg/mL能夠誘發(fā)人肝癌HCCLM3細胞明顯阻滯于G2～M期。

細胞周期阻滯后通常會誘導線粒體膜電位改變，線粒體跨膜電位下降被認為是細胞凋亡級聯(lián)反應過程中最早發(fā)生的事件，一旦線粒體膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉[8]。本研究中熒光倒置顯微鏡觀察結果顯示，GLA 5、10 μg/mL作用于HCCLM3細胞24 h，均可誘導線粒體膜電位下降，其中GLA 10 μg/mL誘導作用更為明顯。流式細胞術檢測結果也證實，GLA 10 μg/mL作用于HCCLM3細胞24 h，其促凋亡作用更為明顯。這提示GLA促進細胞凋亡與其誘導線粒體膜電位下降相關，GLA能夠通過線粒體途徑促進細胞凋亡[9]。

Bax與Bcl-2是線粒體凋亡途徑的重要因子，也是內源性凋亡的主要調控者。研究顯示，細胞受到信號分子刺激后，Bax形成寡聚體，從細胞質轉移到線粒體膜上，與Bcl-2形成多聚體，通過在線粒體外膜上形成孔洞來增強線粒體膜的通透性，誘導細胞色素C釋放，誘發(fā)caspase蛋白酶家族的酶聯(lián)激活，促進細胞凋亡[10]。Bcl-2的過表達與較多腫瘤的發(fā)生密切相關，以Bcl-2為靶點的藥物研究一直是抗腫瘤藥物研究的熱點[11-13]。

香茶菜屬于傳統(tǒng)中草藥，因其活性強、毒性小而備受關注。GLA是從香茶菜中分離提取的活性成分，民間用于抗炎、抗腫瘤治療歷史悠久[1-3]?；A研究顯示，在肝癌、膀胱癌、骨肉瘤等裸鼠模型中，GLA能夠顯著抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡，且對主要臟器無明顯的毒副作用[2-4，9]。本研究中流式細胞術檢測結果顯示，GLA 10 μg/mL能夠顯著促進細胞凋亡;Western blot檢測結果進一步證實，GLA 10 μg/mL能夠顯著促進Bax、cleaved caspase-3、Beclin1蛋白表達，顯著抑制Bcl-2蛋白表達。這提示GLA可通過線粒體通路促進HCCLM3細胞凋亡，且存在劑量效應趨勢。

細胞自噬作為細胞程序性死亡的另一種方式，與細胞凋亡密切相關。線粒體也是參與細胞自噬的重要細胞器。Beclin1介導的自噬信號通路與Bax/Bcl-2線粒體凋亡通路之間存在交叉[14-15]。Beclin1通過BH3結構域與Bcl-2結合，競爭性地抑制Bax與Bcl-2的結合，導致Bax/Bcl-2比值升高，促進細胞凋亡;相反，Beclin1也可與Bcl-2解離，不影響B(tài)ax與Bcl-2的結合，同時釋放游離Beclin1，促進細胞自噬[14]。研究顯示，Beclin1過表達可以降低線粒體膜電位，并通過與Bcl-2結合增加順鉑誘導的細胞凋亡[15];孕酮受體拮抗劑能夠減弱Bcl-2與Beclin1結合，通過Bcl-2/Beclin1軸調節(jié)子宮肌瘤細胞自噬與凋亡[16];氧化魚油也能夠抑制Bcl-2與Beclin1結合從而促進細胞自噬，并導致線粒體功能障礙[17]。Beclin1與Bcl-2的結合在調節(jié)細胞自噬與凋亡轉歸中意義重大。本研究通過免疫共沉淀法檢測，結果顯示Bcl-2與Beclin1在HCCLM3細胞中相互作用，且GLA 10 μg/mL作用于HCCLM3細胞 24 h，能夠促進Bcl-2與Beclin1結合。再根據(jù)Western blot法檢測結果，筆者推測GLA 10 μg/mL在促進Bcl-2與Beclin1結合的同時，也促進HCCLM3細胞表達Bax蛋白，使細胞中Bax/Bcl-2比值升高，從而促進細胞凋亡。同時，由于Bcl-2與Beclin1的結合抑制了Beclin1參與細胞自噬激活，所以GLA 10 ?μg/mL的作用主要表現(xiàn)為促進細胞凋亡。相較而言，GLA 5 μg/mL作用于HCCLM3細胞24 h后，細胞中Bcl-2與Beclin1的結合較少，因此，該劑量GLA促進細胞自噬的作用較為明顯，透射電鏡下可見細胞內出現(xiàn)較多自噬小體。以往研究也顯示，Bcl-2與細胞凋亡蛋白和細胞自噬蛋白存在交叉反應[18-19]，提示Bcl-2極有可能在細胞自噬與凋亡之間起關鍵性調控作用。

研究顯示，多種中草藥活性成分均能夠誘發(fā)腫瘤細胞凋亡并激活細胞自噬，對腫瘤細胞的生物學行為進行雙向調節(jié)[20]。筆者團隊前期研究結果顯示，GLA對人肝癌HCCLM3細胞的炎癥反應、侵襲能力、遷移能力具有雙向調節(jié)作用，且效果呈劑量效應關系[7]。本研究結果顯示，GLA可通過線粒體途徑促進細胞自噬與凋亡，并對Bcl-2與Beclin1的結合與解離具有雙向調節(jié)作用，提示GLA可能通過Bcl-2/Beclin1靶點調節(jié)HCCLM3細胞自噬與凋亡，作用效果依然可能呈劑量效應關系。

綜上所述，GLA可能通過Bcl-2/Beclin1靶點調節(jié)HCCLM3細胞自噬與凋亡，且作用效果與劑量密切相關。

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（收稿日期：2021-10-26 修回日期：2022-03-06）

（編輯：舒安琴）