鄒偉，趙歆，張新樂，王琦

（昆明醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，云南昆明 650500）

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）因具有生長周期短、便于操作、易于觀察等特點，成為研究銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的侵染模型。線蟲神經(jīng)系統(tǒng)有302個神經(jīng)元，免疫體系在抵抗致病菌及環(huán)境應(yīng)激方面發(fā)揮作用的同時，也對神經(jīng)及發(fā)育系統(tǒng)等產(chǎn)生影響[1]。與脊椎動物相比，線蟲免疫體系簡單并保守，有助于研究信號轉(zhuǎn)導和天然免疫機制，此外可用于基于病毒相關(guān)微生物基因和免疫的宿主基因的鑒定[2]。銅綠假單胞菌是一種醫(yī)院獲得性、機會性、革蘭氏陰性細菌，可引起多種疾病，包括免疫功能低下患者的急性感染和囊性纖維化患者的慢性肺部感染[3]。在臨床水平上，銅綠假單胞菌能迅速產(chǎn)生抗生素耐藥性并形成生物膜，因此治療感染患者非常困難[4]。此外，銅綠假單胞菌是住院患者感染的常見病因，占所有醫(yī)院感染的11%～14%，僅次于大腸桿菌和克雷伯菌[5]。銅綠假單胞菌感染通常具有較高的發(fā)病率和死亡率，盡管醫(yī)院護理有所改善，但預后效果不良，死亡率為33%～61%，這給開發(fā)現(xiàn)有藥物的替代抗菌策略帶來了緊迫感[5]。本文綜述了銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲侵染、宿主應(yīng)對策略，為研究銅綠假單胞菌致病機制及篩選治療其引發(fā)疾病的治療思路提供了參考。

1 銅綠假單胞菌侵染秀麗隱桿線蟲研究

1.1 銅綠假單胞菌侵染的影響

實驗室常用的銅綠假單胞菌菌株有PA01、PA14等，其毒力因子系統(tǒng)包含2類。①分泌到細胞外，其中最具毒力的是Ⅲ型分泌系統(tǒng)[6-7]。②附著于細胞表面[8-9]。PA01對秀麗隱桿線蟲具有較強毒力，飼喂后線蟲存活時間比食物大腸桿菌OP50短約168 h。線蟲發(fā)育經(jīng)歷L1～L4共4個時期，L4期的秀麗隱桿線蟲在銅綠假單胞菌菌株P(guān)A14的毒性作用下更易感。銅綠假單胞菌侵染對線蟲的生理造成嚴重影響，如生長發(fā)育變緩、運動能力下降、產(chǎn)卵量減少和體內(nèi)脂肪含量降低等[10-11]。當然，不同銅綠假單胞菌菌株對線蟲產(chǎn)生的影響不盡相同，PA14不同的存活狀態(tài)會對線蟲基因的表達造成影響[12]。如表1所示，將線蟲置于熱滅活前后的PA14中基因表達發(fā)生改變[13]。

表1 熱滅活前后PA14誘導線蟲基因表達

1.2 銅綠假單胞菌造成秀麗隱桿線蟲死亡的類型及機制

銅綠假單胞菌是一種自由生活的變形菌，具有感染包括人類在內(nèi)的多種動物宿主的能力，銅綠假單胞菌侵染后造成線蟲死亡的類型主要包括快殺（Fast Killing）、慢殺（Slow Killing），麻痹致死（Paralytic Killing）和液體致死（Liquid Killing），詳見表2。秀麗隱桿線蟲是研究細菌致病性非常有價值的模型，當銅綠假單胞菌菌株P(guān)A14在線蟲生長（NGM）培養(yǎng)基上生長時，培養(yǎng)基細胞定殖于線蟲腸道，并在2～3 d內(nèi)緩慢殺死線蟲[10]。在慢殺的過程中，細菌通過群體感應(yīng)（QS）調(diào)節(jié)途徑參與毒力促進基因表達程序[13]，此外，ToxA毒素可抑制線蟲蛋白質(zhì)的翻譯及合成[14]。相比之下，在高滲壓培養(yǎng)基（PGS）上生長的PA14由于產(chǎn)生低分子量毒素，殺滅線蟲的速度要快得多，一般在4～24 h內(nèi)快速殺滅。另一株銅綠假單胞菌菌株P(guān)A01在BHI肉湯中生長時，可通過氰化物中毒從而麻痹性殺死線蟲[15]。此外，NATALIA等使用NGC建立液體致死試驗，將銅綠假單胞菌懸浮在補充有5 mg/mL膽固醇的S-basal中，調(diào)整OD，加入一定量線蟲后，測定存活率。鐵誘導的低氧致死反應(yīng)在液體殺死線蟲過程中起到關(guān)鍵作用[16]。

表2 銅綠假單胞菌造成秀麗隱桿線蟲死亡的類型

近年來，研究發(fā)現(xiàn)在慢殺過程中，接觸銅綠假單胞菌PA14后，秀麗隱桿線蟲經(jīng)歷完整核糖體的快速丟失，伴隨著在核糖體26S rRNA H69處切割的核糖體的積累。H69處的26S rRNA斷裂不是對應(yīng)激或細胞死亡的應(yīng)激反應(yīng)，而是特異于銅綠假單胞菌毒力的機制。H69的切割依賴于細菌毒力程序的基因調(diào)控，包括QS系統(tǒng)，且不依賴于ToxA介導的翻譯抑制。H69核糖體裂解揭示了一種新的毒力機制，即銅綠假單胞菌可抑制動物宿主的蛋白翻譯過程[17]。

2 秀麗隱桿線蟲防御銅綠假單胞菌侵染應(yīng)對策略

秀麗隱桿線蟲常暴露于多種致病菌及多種未知危險的生存環(huán)境中，PA可以使線蟲致死，線蟲亦可以對PA侵染產(chǎn)生防御機制。秀麗隱桿線蟲對PA主要通過由角質(zhì)層組成的物理屏障、行為反應(yīng)和秀麗隱桿線蟲體內(nèi)形成固有免疫防御系統(tǒng)的生理防御[18]。此外，當秀麗隱桿線蟲接觸到病原菌后的逃避行為也是必然選擇[19]。

2.1 秀麗隱桿線蟲對銅綠假單胞菌的先天免疫反應(yīng)

秀麗隱桿線蟲對銅綠假單胞菌的先天免疫反應(yīng)主要通過以下信號通路實現(xiàn)，第1條信號通路由p38/MAPK通路介導，該途徑由G蛋白α亞基（GPA）和磷酸化酶Cβ（PLCβ）調(diào)節(jié)腸道內(nèi)p38 MAP激酶的活性抵抗病原菌侵染[20-21]。第2條信號通路由DBL-1介導，線蟲中與哺乳動物轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）通路同源的DBL-1參與線蟲抵御病原菌侵染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)[22]。第3條信號通路由DAF-2/DAF-16介導，該通路高度保守，DAF-16是抵抗侵染的重要調(diào)節(jié)蛋白，線蟲受到銅綠假單胞菌侵染后會激活DAF-2胰島素樣信號通路抑制宿主免疫[23]。此外，LET-7在線蟲腸道或神經(jīng)元中參與對PA14侵染固有免疫反應(yīng)的分子調(diào)控[24]，在AIB中間神經(jīng)元過表達NPR-9導致線蟲對的防御機制降低[25]。

2.2 秀麗隱桿線蟲對銅綠假單胞菌逃避反應(yīng)

秀麗隱桿線蟲受到銅綠假單胞菌侵染后，會表現(xiàn)出逃離病原菌的行為，稱之為逃避反應(yīng)。根據(jù)逃避反應(yīng)調(diào)控機制的不同，可分為應(yīng)激性逃避行為（本能逃避）和學習型逃避行為。其中，TAX-4/TAX-2環(huán)鳥甘酸門控通道（TAX-4/TAX-2 cGMP-gated Channel）、胰島素受體DAF-2、神經(jīng)肽受體NPR-1和泛素化E3連接酶HECW-1則參與本能逃避行為，五羥色胺TPH-1、TGF-β信號通路配體DBL-1、DAF-7和胰島素信號肽INS-6、INS-7參與調(diào)控線蟲學習型病原逃避[19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA miR-67參與了行為回避反應(yīng)，銅綠假單胞菌PA14在線蟲中誘導miR-67的表達，miR-67（n4899）突變體表現(xiàn)出規(guī)避銅綠假單胞菌PA14的能力降低[26]。

3 結(jié)語

銅綠假單胞菌等病原體通過釋放毒素或改變動物宿主生理狀態(tài)而有利于自身的侵染，在侵染過程中，產(chǎn)生如粘附分子、分泌系統(tǒng)和包括蛋白酶在內(nèi)的毒性因子，增強致病和損害宿主組織的能力，其發(fā)病機制是毒力因子協(xié)調(diào)作用的表現(xiàn)。作為應(yīng)對銅綠假單胞菌侵染的回應(yīng)，秀麗隱桿線蟲激活先天免疫，同時產(chǎn)生逃避反應(yīng)。近期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)典免疫基因pmk-1突變引起的先天免疫缺陷促進了線蟲的逃避行為，pmk-1在OLL神經(jīng)元中與E3泛素連接酶HECW-1共定位，并調(diào)節(jié)后者的表達水平，從而影響NPR-1的產(chǎn)生。當秀麗隱桿線蟲對抗細菌感染時，一旦先天免疫受到損害，逃避的防御策略可通過HECW-1/NPR-1模塊調(diào)控增強，提示神經(jīng)回路中的GPCR可能接收來自免疫系統(tǒng)的輸入，整合這兩個系統(tǒng)以更好地適應(yīng)不利環(huán)境[27]。銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲侵染模型為銅綠假單胞菌毒力因素、線蟲的天然防御及對銅綠假單胞菌耐藥機制的探索等方面研究提供更廣泛的思路。