林育婷

（英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技股份有限公司，福建廈門(mén)361000）

胱抑素C（Cystain C，Cys C）又名半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine Proteinase Inhibitor，CPI），是一種非糖基化的堿性蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量較小，在體內(nèi)唯一的代謝途徑是通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)排泄。自1985年以來(lái)，胱抑素C已被視為檢測(cè)腎功能的良好標(biāo)志物，可作為腎小球?yàn)V過(guò)功能的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，是一種理想的內(nèi)源性標(biāo)志物，在一系列生理病理過(guò)程中也發(fā)揮著作用，有重要的臨床意義[1]。

胱抑素C的測(cè)定方法很多，目前使用較廣泛的是在全自動(dòng)生化分析儀上使用的透射免疫比濁法[2]。透射免疫比濁法的檢驗(yàn)原理是反應(yīng)生成不溶性的抗原-抗體復(fù)合物，并產(chǎn)生一定的濁度，所以濁度值直接反映樣品中抗原的含量。透射免疫比濁法雖然具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定速度快、無(wú)污染、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，但在檢測(cè)高濃度標(biāo)本時(shí)，會(huì)因抗原過(guò)量產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)使反應(yīng)信號(hào)減弱，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低[3]。不同品牌的檢測(cè)儀器，因信號(hào)量程、測(cè)定程序、數(shù)據(jù)分析模式等的不同，發(fā)生抗原過(guò)量鉤狀效應(yīng)的結(jié)果可能不同。本文對(duì)研制的胱抑素C試劑在兩種全自動(dòng)生化分析儀上的鉤狀效應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較，分析其對(duì)臨床結(jié)果造成偏差的風(fēng)險(xiǎn)，并設(shè)法減小這種風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗原，北京百川飛虹生物科技有限公司；抗體，購(gòu)自DAKO公司；胱抑素C測(cè)定試劑，英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技股份有限公司；胱抑素C基礎(chǔ)緩沖液，英科新創(chuàng)（廈門(mén)）科技股份有限公司。

1.2 儀器

Hitachi 7180全自動(dòng)生化分析儀，吸光度測(cè)定量程-3.2～3.2，日本日立公司；Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀，吸光度測(cè)定量程-2.5～2.5，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 測(cè)定程序

Hitachi 7180全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定程序：測(cè)定波長(zhǎng)546 nm，測(cè)光點(diǎn)18～34，測(cè)定模式為兩點(diǎn)終點(diǎn)法，定標(biāo)方式為6點(diǎn)定標(biāo)（Logit-log（4P）擬合）。

Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定程序：測(cè)定波長(zhǎng)540 nm，測(cè)光點(diǎn)14～27，測(cè)定模式為終點(diǎn)法，定標(biāo)方式為6點(diǎn)定標(biāo)（Spline擬合）。

1.3.2 不同濃度梯度的胱抑素C抗原溶液的制備

將胱抑素C抗原用胱抑素C基礎(chǔ)緩沖液復(fù)溶，配制成理論濃度為0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0 mg/L、12.0 mg/L、14.0 mg/L、16.0 mg/L、18.0 mg/L、20.0 mg/L、25.0 mg/L、30.0 mg/L、35.0 mg/L、40.0 mg/L、45.0 mg/L及50.0 mg/L的19個(gè)濃度梯度。

1.3.3 繪制劑量-效應(yīng)曲線

將上述19個(gè)濃度的胱抑素C抗原溶液分別在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次，以3次檢測(cè)結(jié)果的反應(yīng)吸光度均值為縱坐標(biāo)，胱抑素C抗原溶液的理論濃度為橫坐標(biāo)，用Excel表格做出相應(yīng)的散點(diǎn)圖和趨勢(shì)線，繪制成劑量-效應(yīng)曲線。根據(jù)曲線，對(duì)胱抑素C在兩種儀器上的鉤狀效應(yīng)進(jìn)行比較分析。

1.3.4 鉤狀效應(yīng)差異的改善方法

分別采用不同濃度的抗體用量（75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L）配制胱抑素C試劑，按上述方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果判斷是否能解決不同檢測(cè)儀器間鉤狀效應(yīng)差異的問(wèn)題。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種儀器的劑量-效應(yīng)曲線

從圖1、圖2可以看出，不同抗體用量配制的胱抑素C試劑，在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定0～50 mg/L的不同濃度梯度的抗原溶液，均存在明顯的鉤狀效應(yīng)。樣品的反應(yīng)吸光度起初隨著抗原濃度的升高而升高，在到達(dá)平衡點(diǎn)濃度之后反應(yīng)吸光度隨著抗原濃度的升高反而減小。如圖1所示，當(dāng)試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和 150 mg/L時(shí)， 在7180分析儀上測(cè)定胱抑素C抗原，其抗原-抗體結(jié)合達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí)的抗原濃度（即HOOK濃度）分別約為 12 mg/L、14 mg/L、18 mg/L和 18 mg/L，超過(guò)以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢(shì)。如圖2所示，當(dāng)試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L時(shí)，在AU680分析儀上測(cè)定胱抑素C抗原，其抗原-抗體結(jié)合達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí)的HOOK濃度分別約為10 mg/L、12 mg/L、12 mg/L和10 mg/L，超過(guò)以上濃度后劑量-效應(yīng)曲線呈下降趨勢(shì)。

圖1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在日立7180上的劑量-效應(yīng)曲線

圖2 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在AU680上的劑量-效應(yīng)曲線

2.2 鉤狀效應(yīng)差異分析

不同抗體用量配制的胱抑素C在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動(dòng)生化分析儀上雖然有類(lèi)似的鉤狀效應(yīng)趨勢(shì)，但出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度有所區(qū)別：在7180分析儀上，隨著試劑抗體濃度的增加，出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度也有較明顯增加；在AU680分析儀上，隨著試劑抗體濃度的增加，出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度增加不明顯，且相同抗體用量配制的胱抑素C在AU680分析儀上的HOOK濃度均比在7180分析儀上低。此種情況的發(fā)生，可能為AU680儀器的測(cè)定量程較?。ㄗ畲鬁y(cè)定量程為2.5），當(dāng)試劑抗體濃度大于125 mg/L時(shí)，反應(yīng)吸光度已接近儀器的最大量程，所以隨著抗體濃度的增加，儀器測(cè)定量程的限制可能影響了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性（見(jiàn)表1）。此外，儀器的加樣時(shí)間點(diǎn)、測(cè)光點(diǎn)、數(shù)據(jù)擬合方式不同，也可能是造成此種現(xiàn)象的原因[4]。

表1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)的HOOK濃度和反應(yīng)吸光度

有研究表明，試劑中抗體濃度越高，所能準(zhǔn)確測(cè)量到的抗原濃度也越高，試劑安全報(bào)告范圍也越寬，鉤狀效應(yīng)出現(xiàn)的概率會(huì)大大減小[5]。但試劑在臨床應(yīng)用上，需要適配多種型號(hào)的儀器，儀器的測(cè)量差異也應(yīng)是試劑研發(fā)過(guò)程中需要綜合考慮的。本產(chǎn)品胱抑素C試劑的線性范圍要求為0～8 mg/L，健康成人血清胱抑素C的參考范圍為0.59～1.03 mg/L，臨床患者血清胱抑素C濃度在12 mg/L以上的也較少，因此綜合考慮試劑的質(zhì)量要求、儀器的測(cè)量差異以及臨床檢測(cè)的需求，選擇本試劑的抗體濃度為100 mg/L。選擇此抗體濃度，在7180分析儀中的HOOK濃度約為14 mg/L，在AU680分析儀上的HOOK濃度約為12 mg/L，二者均超過(guò)試劑線性范圍要求的上限，對(duì)于在線性范圍之內(nèi)的樣本，均能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也能覆蓋臨床常見(jiàn)的樣本濃度。

3 結(jié)論

鉤狀效應(yīng)是免疫比濁試劑不可避免的問(wèn)題，本試劑在研發(fā)過(guò)程中，在優(yōu)化配方的同時(shí)，也綜合考慮了儀器的測(cè)量差異，根據(jù)研究結(jié)果確定了抗體的最佳用量。同時(shí)，通過(guò)此研究，對(duì)所研制的試劑有了更準(zhǔn)確的HOOK效應(yīng)數(shù)據(jù)，以此指導(dǎo)臨床檢測(cè)過(guò)程中對(duì)抗原超限標(biāo)本進(jìn)行稀釋處理，避免在檢測(cè)過(guò)程中由于檢測(cè)儀器的不同而造成超高值標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。