李嶺，黃銘銳，郭嘉鑫，陳志

（青海師范大學(xué)，青海西寧 810008）

鎖陽(yáng)，首載于《本草衍義補(bǔ)遺》，為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉質(zhì)莖，又名不老藥[1]。主要含有有機(jī)酸類、黃酮類、三萜類、糖苷類、甾體類、氨基酸及無(wú)機(jī)離子等多種生理活性物質(zhì)，抗寒耐干旱[2-4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，鎖陽(yáng)可提高機(jī)體的免疫能力、清除自由基、抑制人體免疫缺陷病毒[5]。

鎖陽(yáng)黃酮是指從鎖陽(yáng)中提取的黃酮單體。近年來(lái)，黃酮類化合物日益受到人們的青睞，各種富含黃酮類化合物的植物中草藥資源相繼被開(kāi)發(fā)利用[6]。其中，(-)-表沒(méi)食子兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸酯（EGCG）可以通過(guò)清除機(jī)體氧自由基、減少氧自由基過(guò)度生成、激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激機(jī)制、免疫調(diào)節(jié)等多種分子機(jī)制避免肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷[7]。

肝細(xì)胞氧化損傷是導(dǎo)致許多肝病，諸如脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝纖維化和肝癌等，的重要原因之一。盡管臨床上已有許多治療肝病的藥物，但是大多藥物的有效性與毒副作用問(wèn)題仍然存在。因此尋找新的天然藥物，對(duì)于肝病的臨床治療具有重要意義。本研究通過(guò)探討鎖陽(yáng)黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，以期為肝病的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖陽(yáng)，購(gòu)于青海省西寧市中藥房；大鼠星狀肝細(xì)胞，青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；SDS、MTT，Sigma公司；PBS（pH 7.4），上海前塵生物科技公司；胰蛋白酶-EDTA、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清，Hyclone公司；大鼠丙二醛（MDA）ELISA試劑盒、大鼠一氧化氮合酶（NOS）ELISA試劑盒、大鼠細(xì)胞蛋白ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物工程有限公司；HPD-722大孔吸附樹(shù)脂，滄州寶恩化工有限公司；聚酰胺層析薄膜，上?；鄯f生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BX43熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；BSC-1500B2-X生物安全柜，濟(jì)南圣科環(huán)?？萍加邢薰?；Bio-Rad XMARK全自動(dòng)酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；HF90二氧化碳培養(yǎng)箱，香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；UV-1780紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鎖陽(yáng)黃酮提取及溶液配制

將鎖陽(yáng)粉碎后過(guò)100目篩，石油醚脫脂后所得殘?jiān)c5%NaOH溶液按1∶10的質(zhì)量體積比進(jìn)行配制，浸提3次，每次3 h，合并上清液。使用鹽酸酸化后用氯仿萃取，濃縮有機(jī)層。將所得浸膏用HPD-722大孔吸附樹(shù)脂富集鎖陽(yáng)黃酮，再經(jīng)聚酰胺柱層析分離富集，收集50%～75%乙醇洗脫液合并濃縮，冷凍干燥得到鎖陽(yáng)黃酮粉末[8]。

提取物中總黃酮含量的測(cè)定按文獻(xiàn)[9]中的方法并稍作修改。以濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定提取物中的黃酮含量（LCH，%），鎖陽(yáng)總黃酮含量（TFC，mg/g）計(jì)算方法如式（1）：

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取大鼠肝星狀細(xì)胞移至一次性培養(yǎng)瓶中，加入含有1%雙抗、10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2孵化箱中持續(xù)培育至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的大鼠肝星狀細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.3 過(guò)氧化氫溶液濃度的篩選

不同濃度的過(guò)氧化氫對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的損傷程度各有差異，因此考察不同氧化劑濃度對(duì)細(xì)胞的致?lián)p狀況?？疾爝^(guò)氧化氫濃度分別為200 μmoL/mL、400 μmoL/mL和800 μmoL/mL下大鼠肝星狀細(xì)胞的活力。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，向孔板中加入不同濃度的過(guò)氧化氫溶液，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.3.4 鎖陽(yáng)黃酮溶液對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果

實(shí)驗(yàn)設(shè)立空白組、陰性對(duì)照組、過(guò)氧化氫損傷模型組（200 μmoL/mL）和鎖陽(yáng)黃酮（濃度分別為0 μg/mL、12.5 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL和200.0 μg/mL）給藥組，每組3個(gè)復(fù)孔。37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，在510 nm處測(cè)定OD值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 MDA、NOS、蛋白濃度的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠肝星狀細(xì)胞，用PBS洗滌后，經(jīng)0.25%的胰酶消化離心去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度。給藥組分別加入25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的鎖陽(yáng)黃酮溶液，培養(yǎng)12 h后按試劑盒操作步驟測(cè)定細(xì)胞中MDA、NOS及蛋白濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎖陽(yáng)黃酮含量的測(cè)定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理得回歸方程Y=12.120 5X-1.785 7×10-4，R2=0.999 9。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得提取物中的黃酮含量（LCH）為87%，從式（1）得鎖陽(yáng)總黃酮含量（TFC）為202.83 mg/g。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 過(guò)氧化氫溶液濃度篩選

如表1所示，過(guò)氧化氫濃度與細(xì)胞的生長(zhǎng)存活率呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞死亡率過(guò)大時(shí)（≥70%），說(shuō)明該損傷濃度不具有實(shí)驗(yàn)意義，故本實(shí)驗(yàn)選取200 μmoL/mL的過(guò)氧化氫溶液建立體外氧化損傷模型。

表1 過(guò)氧化氫濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存活率的影響（±s，n=9）

表1 過(guò)氧化氫濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)存活率的影響（±s，n=9）

注：與對(duì)照組比較，*為P＜0.05（差異顯著），**為P＜0.01（差異極顯著）。

組別 過(guò)氧化氫濃度/（μmoL/mL） 細(xì)胞生長(zhǎng)存活率/%陰性對(duì)照組 100 200 42.88±3.21**400 25.72±2.73**800 14.15±3.02**實(shí)驗(yàn)組

2.3 鎖陽(yáng)黃酮樣品濃度的篩選

由圖2可知，在0～100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，鎖陽(yáng)黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用；當(dāng)濃度大于100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率急劇減?。?5～100 μg/mL的鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的保護(hù)作用明顯。數(shù)據(jù)表明，高濃度的鎖陽(yáng)黃酮（＞100 μg/mL）對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，因此本實(shí)驗(yàn)選取濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的鎖陽(yáng)黃酮進(jìn)行細(xì)胞抗氧化損失實(shí)驗(yàn)。

圖2 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的保護(hù)作用

2.4 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.4.1 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞中蛋白濃度的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝星狀細(xì)胞中的蛋白濃度顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。而低、中、高劑量的鎖陽(yáng)黃酮溶液使大鼠肝星狀細(xì)胞中的蛋白濃度分別減少13.59%（P＜0.05）、18.55%（P＜0.01）和26.38%（P＜0.01）。說(shuō)明鎖陽(yáng)黃酮可以抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞蛋白濃度的增加。

表2 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用（±s，n=9）

表2 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用（±s，n=9）

注：與模型組比較，*為P＜0.05（差異顯著），**為P＜0.01（差異極顯著）；與對(duì)照組比較，#為P＜0.05（差異顯著），##為P＜0.01（差異極顯著）。

組別 蛋白濃度/（g/L） MDA/（nmol/mg） NOS/（U/mL）對(duì)照組 15.41±1.32 1.32±0.13 9.19±0.82損傷模型組 33.04±2.87## 2.56±0.19## 6.32±0.59#25 μg/mL 鎖陽(yáng)黃酮組 26.62±2.14* 1.83±0.08** 6.07±0.71 50 μg/mL 鎖陽(yáng)黃酮組 26.91±2.84** 1.62±0.07** 7.56±0.73*100 μg/mL 鎖陽(yáng)黃酮組 24.32±3.01** 1.55±0.14** 8.13±0.92*

2.4.2 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞中MDA的影響

如表2所示，當(dāng)用200 μmol/mL的過(guò)氧化氫溶液對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞形成氧化損傷后，大鼠肝星狀細(xì)胞中的MDA含量增加到2.56 nmol/mg，細(xì)胞氧化損傷造模成功。加入低、中、高劑量不同濃度的鎖陽(yáng)黃酮溶液后，大鼠肝星狀細(xì)胞中的MDA含量分別減少28.52%、36.72%和39.45%（P＜0.01）。說(shuō)明鎖陽(yáng)黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞MDA含量的增加具有拮抗作用。

2.4.3 鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞中NOS的影響

如表2所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝星狀細(xì)胞中的NOS含量顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明造模成功。低劑量的鎖陽(yáng)黃酮溶液對(duì)氧化損傷的大鼠肝星狀細(xì)胞NOS無(wú)明顯影響（P＞0.05），而中劑量和高劑量的鎖陽(yáng)黃酮溶液使大鼠肝星狀細(xì)胞中的NOS含量分別增加19.44%（P＜0.05）和28.57%（P＜0.05）。說(shuō)明中、高濃度鎖陽(yáng)黃酮對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞NOS表達(dá)的降低具有拮抗作用。

過(guò)氧化氫是一種重要的活性氧，極易通過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)鐵離子反應(yīng)形成高活性O(shè)H·損傷細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，體內(nèi)的高活性分子產(chǎn)生過(guò)多，細(xì)胞中出現(xiàn)大量自由基，引起大鼠肝星狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的改變，加劇肝細(xì)胞的損傷程度并導(dǎo)致組織損傷，而肝星狀細(xì)胞活化是引起肝纖維化的主要原因[9-11]。

黃酮類化合物對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的氧化損傷有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，一定濃度范圍內(nèi)（25～100 μg/mL）的鎖陽(yáng)黃酮作用于過(guò)氧化氫處理的大鼠肝細(xì)胞時(shí)，有顯著的抗氧化作用。鎖陽(yáng)黃酮通過(guò)提高受到抑制的細(xì)胞活性，改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，降低MDA含量，從而減少細(xì)胞壞死。當(dāng)鎖陽(yáng)黃酮濃度超過(guò)100 μg/mL時(shí)，鎖陽(yáng)黃酮對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的抑制率增加，表現(xiàn)出毒副作用。

3 結(jié)論

綜上所述，本研究表明鎖陽(yáng)黃酮對(duì)于過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用，它提高了細(xì)胞存活率、降低了細(xì)胞蛋白濃度和MDA含量、增加了NOS蛋白表達(dá)水平。這將為鎖陽(yáng)黃酮作為治療肝臟纖維化的天然藥物開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。