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        兩種造模方法對高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮功能的比較

        2022-05-16 03:34:28王嫣陳天琪楊進文王琴嬌高佳楊
        生物化工 2022年2期
        關(guān)鍵詞:血清

        王嫣,陳天琪,楊進文,王琴嬌,高佳楊

        (貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州貴陽 550025)

        近年來,隨著生活水平的提高,人們?nèi)粘I攀持懈咧?、高蛋白的食物攝入率較高,導(dǎo)致高脂血癥的發(fā)病率也逐年升高。研究表明,血脂升高會直接削弱動脈壁的抗氧化功能,引起血管內(nèi)皮功能損傷[1],增加血管內(nèi)皮的通透性,使炎癥細胞、凝血物質(zhì)及脂質(zhì)聚積,加劇血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng),進而引起血管內(nèi)皮功能障礙[2],并繼發(fā)動脈粥樣硬化、高血壓、腦卒中等心腦血管疾病[3]。因此,改善內(nèi)皮功能障礙對防治高脂血癥等心血管疾病有非常重要的作用。

        高脂血癥的發(fā)病機制尚未完全闡明,因此需要通過建立動物模型進行深入研究。目前,建立高脂血癥動物模型的方法較多,有高脂乳劑灌胃法、高脂飼料喂養(yǎng)法、激素注射法、鉛灌胃法等[4],其中以高脂乳劑灌胃法和高脂飼料喂養(yǎng)法較為常用。為了進一步比較這兩種方法的造模效果,本實驗選取SD大鼠為研究動物,用這兩種方法同時進行造模,通過檢測大鼠血脂水平的變化,對比這兩種方法的造模效果。同時觀察大鼠血清中C反應(yīng)蛋白(CRP)、白介素(IL-6)以及內(nèi)皮素(ET-1)水平的變化,評價這兩種造模方法對血管內(nèi)皮細胞功能的影響,為高脂血癥動物模型的建立提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        健康SPF雄性(7~8周齡)SD大鼠24只,體重180~220 g,購自長沙天勤生物公司,許可證號:Scxk(湘)2019-0013。

        1.2 藥物

        膽固醇,批號L24F11F108900,源葉生物;脫氧膽酸鈉,批號S04N11J130012,源葉生物;吐溫-80,批號Z01S11Y123117,源葉生物;丙硫氧嘧啶片,批號20200831,上海朝暉藥業(yè)有限公司;維生素D2注射液,批號20010401,江西贛南海欣藥業(yè)股份有限公司;普通飼料和高脂飼料(配方為20%蔗糖、15%豬油、0.8%膽固醇、0.2%膽酸鈉),長沙天勤生物公司。

        1.3 試劑盒

        膽固醇(TC)試劑盒,批號20201104;甘油三酯(TC)試劑盒,批號20201103;高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)試劑盒,批號20201104;低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)試劑盒,批號20201104;ET-1試劑盒,批號20201207;CRP試劑盒,批號20201207;IL-6試劑盒,批號20201207。所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

        1.4 儀器

        Multiskan GO酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;SC-02低速離心機,安徽中佳科學(xué)儀器有限公司;JJ2248BC型電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠;DHG-9620A電熱恒溫干燥箱,上海拓赫機電科技有限公司。

        1.5 實驗方法

        1.5.1 高脂乳劑的制備

        參照文獻[5]并加以改進,高脂乳劑的配方為20%豬油、10%膽固醇、2%脫氧膽酸鈉、1%丙硫氧嘧啶、5%白糖及20%吐溫-80。配好的高脂乳劑裝入密閉的容器中冷藏保存,使用時置于50 ℃水浴中融化,待溫度適宜后再進行灌胃。

        1.5.2 動物分組及模型制備

        24只大鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機分為空白組、高脂飼料組和高脂乳劑組,每組8只,空白組給予普通飼料喂養(yǎng),高脂飼料組給予高脂飼料喂養(yǎng),高脂乳劑組給予上述自制的高脂乳劑[1 mL(/100 g·d)]灌胃,每日灌胃1次。同時高脂飼料組和高脂乳劑組配合給予腹腔注射維生素D2注射液,首次注射60萬U/kg,然后第3周、第6周、第9周分別注射10萬U/kg。造模時間為10周。

        1.5.3 指標(biāo)檢測

        造模結(jié)束后,大鼠用25%氨基甲酸乙酯(4 mL/kg)腹腔麻醉后,經(jīng)腹主動脈取血3~5 mL,靜置于冰上1~2 h,2 500 r/min離心10 min,取上清液,用試劑盒檢測大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、IL-6、ET-1的含量。

        1.5.4 數(shù)據(jù)處理分析

        用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計,數(shù)據(jù)均以±s表示。用單因素方差分析進行組間比較。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的變化

        首先,為了評價兩種造模方法導(dǎo)致大鼠高脂血癥模型的差異,用高脂乳劑灌胃和高脂飼料喂養(yǎng)大鼠同時造模10周后,檢測了各組大鼠的血脂指標(biāo),結(jié)果如表1所示,與空白組相比,高脂乳劑組大鼠血清TC和LDL-C含量均明顯升高(P<0.05),而高脂飼料組大鼠僅有TC含量明顯升高,且升高的幅度也沒有高脂乳劑組大鼠明顯(P<0.05)。這說明高脂乳劑灌胃導(dǎo)致的大鼠高血脂程度較高脂飼料喂養(yǎng)更高。

        表1 各組大鼠血脂的變化(±s,n=8)

        表1 各組大鼠血脂的變化(±s,n=8)

        注:△,與空白組比較,P<0.05;*,與高脂乳劑模型組比較,P<0.05;下同。

        分組 TC/(mmol/L) TG/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L)空白組 1.24±0.05 0.48±0.03 0.14±0.03 0.52±0.04高脂乳劑組 2.90±0.17△ 0.23±0.01△ 0.24±0.05△ 0.44±0.09高脂飼料組 2.00±0.32△* 0.36±0.05△* 0.13±0.04* 0.40±0.05

        2.2 各組大鼠血清CRP、IL-6、ET-1的水平

        進一步,由于高脂血癥模型與內(nèi)皮功能紊亂密切相關(guān),我們評價了兩種造模方法對大鼠血清中血管內(nèi)皮功能因子CRP、IL-6和ET-1的影響。由表2可見,高脂乳劑組和高脂飼料組大鼠血清CRP、IL-6、ET-1水平均較空白組升高(P<0.05),且高脂乳劑組大鼠血清CRP、IL-6、ET-1水平升高的幅度較高脂飼料組更高。這說明高脂乳劑灌胃導(dǎo)致的大鼠內(nèi)皮功能紊亂程度較高脂飼料喂養(yǎng)更高,其造模高脂血癥的效果更好。

        表2 各組大鼠血清CRP、IL-6、ET-1的水平(±s,n=8)

        表2 各組大鼠血清CRP、IL-6、ET-1的水平(±s,n=8)

        分組 CRP/(μg/mL) ET-1/(ng/L) IL-6/(ng/L)空白組 12.06±1.51 327.00±50.83 71.55±4.13高脂乳劑組 40.27±2.94△ 476.28±62.82△ 96.93±7.41△高脂飼料組 33.32±2.56△* 408.58±63.11△* 94.56±3.07△

        3 討論

        高脂血癥是由于脂質(zhì)代謝異常引發(fā)的疾病,脂質(zhì)代謝紊亂容易導(dǎo)致動脈粥樣硬化(AS)、心肌梗死、腦梗死等心腦血管疾病[6]。臨床上,高脂血癥可分為高膽固醇血癥(血清TC含量升高)、高甘油三酯血癥(血清TG含量升高)、混合型高脂血癥(血清TC與TG含量均升高)和高低密度脂蛋白血癥(血清LDL-C含量升高)4種類型[7]。目前,高脂飼料喂養(yǎng)和高脂乳劑灌胃是建立高脂血癥動物模型較為常用的兩種方法:高脂飼料喂養(yǎng)法是在普通飼料的基礎(chǔ)上,添加膽固醇、豬油或脂肪、蛋黃粉、膽鹽、甲(丙)基硫氧嘧啶等以不同的比例混合而成高脂飼料,通過動物自由攝食形成高血脂;高脂乳劑灌胃法是用豬油、膽鹽、膽固醇、甲(丙)基硫氧嘧啶按不同比例混合,再加入適量的乳化劑攪拌混勻配制后,通過每日定量灌胃制作動物模型[8]。本實驗同時應(yīng)用這兩種方法對大鼠進行造模,連續(xù)造模10周后取血檢測血脂水平的變化。實驗結(jié)果顯示,與空白組相比,高脂飼料組大鼠僅有血清TC水平升高,LDL-C和HDL-C水平均沒有明顯變化,TG水平輕微降低,表明此種方法只能造成高膽固醇血癥模型;而高脂乳劑組大鼠血清TC、LDL-C水平均顯著升高,且升高的幅度顯著高于高脂飼料組,表明高脂乳劑灌胃更容易形成高膽固醇血癥模型和高低密度脂蛋白血癥模型,血脂升高的幅度更明顯,造模效果較高脂飼料喂養(yǎng)好。

        血管內(nèi)皮細胞是血管壁與血液之間的分界細胞,不僅是血液和血管壁之間的屏障,還有重要的內(nèi)分泌功能,能夠合成和釋放多種血管活性因子[9]。內(nèi)皮細胞在高血脂等病理因素刺激時,可發(fā)生內(nèi)皮功能障礙或血管內(nèi)皮損傷,使其合成和分泌多種血管活性物質(zhì),導(dǎo)致細胞因子間的平衡被破壞,打破血管穩(wěn)態(tài)[10]。研究表明,高脂血癥會引起機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),ROS將氧化LDL-C形成氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),ox-LDL會損傷血管內(nèi)皮細胞的結(jié)構(gòu),使內(nèi)皮細胞的通透性增加,進一步引起脂質(zhì)、炎癥細胞、凝血物質(zhì)沉積在血管壁,導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和血管舒張功能障礙[11],使內(nèi)皮細胞合成的一氧化氮(NO)減少(NO在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,能抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化致血管平滑肌舒張,維持血管舒縮功能)[10]。同時引起內(nèi)皮素(ET)的釋放增加,血管的收縮增強,使血液循環(huán)的速度減慢,加速血栓的形成[12-13]。此外,血管內(nèi)皮細胞損傷后還會分泌各種炎癥因子、趨化因子等,促發(fā)炎癥反應(yīng),在以上多種因素的作用下,血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損傷,并黏附大量單核細胞及炎癥細胞,在單核細胞趨化蛋白的作用下遷移至血管內(nèi)皮間隙,分化為巨噬細胞,并吞噬脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細胞,加快動脈粥樣硬化的形成[14]。因此,為了進一步觀察造模后大鼠的血管內(nèi)皮功能及炎癥反應(yīng)的情況,本實驗在造模后同時檢測了大鼠血清中ET-1、IL-6及CRP的水平。結(jié)果顯示,造模后高脂飼料組和高脂乳劑組大鼠血清ET-1、IL-6及CRP的水平均明顯升高,證實高脂血癥會損傷大鼠的血管內(nèi)皮細胞,誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷。而且與高脂飼料組相比,高脂乳劑組各項指標(biāo)的升高幅度更明顯,進一步從血管內(nèi)皮功能損傷的程度說明高脂乳劑灌胃的造模效果更好。

        4 結(jié)論

        本實驗主要比較了用高脂飼料喂養(yǎng)和高脂乳劑灌胃法制作高脂血癥大鼠模型的效果,結(jié)果表明在相同的造模時間內(nèi)用高脂乳劑灌胃,大鼠血脂升高的幅度更大,造模效果更好,而用高脂飼料喂養(yǎng)則可能需要更長的造模時間。但在造模過程中發(fā)現(xiàn),由于反復(fù)灌胃刺激,會增加大鼠的死亡率,因此造模時需要適當(dāng)增加動物的樣本量,還可適當(dāng)降低高脂乳劑配方中豬油的比例以降低乳劑的黏稠度,減輕灌胃操作的困難。

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