李 燕 王慧凱 王 濱 宋春曉 宮凱凱 邢樹禮 滿玉清

1 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部 山東 濱州 256603；2 濱州市中醫(yī)院腦病科 山東 濱州 256601；3 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學研究中心 山東 濱州 256603

復(fù)方延胡索粉劑(當歸、桂枝、雞血藤、延胡索)在臨床上可用于骨關(guān)節(jié)炎的治療。使用前將這四種藥物混勻、研細成粉，熱醋調(diào)勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，涂布于空心貼，固定于患處。該粉劑使用多年，療效較好，得到臨床的一致好評，但在使用中存在一系列問題，如操作繁瑣，大大增加了醫(yī)護人員的時間成本，易污染衣物、貼敷期間活動受限，患者依從性較差。為解決上述問題，本研究擬將其制成復(fù)方延胡索微乳凝膠貼膏。因當歸、桂枝含揮發(fā)性物質(zhì)較多，為提高其穩(wěn)定性，本研究另文闡述。本文側(cè)重于研究延胡索和雞血藤的提取及工藝優(yōu)化，為使提取液最大限度地發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎藥效，以延胡索乙素、延胡索總生物堿、雞血藤總黃酮作為提取指標[1-5]，采用星點設(shè)計得出最佳工藝流程，并通過醋酸致扭體反應(yīng)、二甲苯致耳腫脹實驗[6-9]對提取物進行鎮(zhèn)痛抗炎作用研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量為(19.60±1.12)g，由濱州醫(yī)學院實驗動物中心提供合格證號為SCXK(魯)20200007，飼養(yǎng)于鋪墊鋸末塑料盒內(nèi)，每籠10只飼養(yǎng)，保持環(huán)境室溫在(23±2)℃，12 h/12 h 晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。

1.2 儀器與試劑 KH7200型超聲清洗儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)，UV-1800型紫外分光光度計(日本島津公司)，安捷倫LC1100高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，延胡索乙素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號為B21426)，雞血藤(河北安國市騰越藥業(yè)有限公司，批號為20200003)，延胡索(河北安國市騰越藥業(yè)有限公司，批號為20200103)，地塞米松磷酸鈉注射液(1 ml∶5 mg，湖北天藥藥業(yè)股份有限公司，批號為52107251)

本研究所用藥材經(jīng)濱州市中醫(yī)院著名老中醫(yī)王君教授鑒定。延胡索Corydalis Rhizoma為罌粟科多年生草本植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang 的干燥塊莖。雞血藤系豆科植物密花豆 Spatholobus suberectus Dunn的干燥藤莖。所留存標本均收置于濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院標本室。

2 方法

2.1 不同提取方式提取液的制備 延胡索的主要藥效物質(zhì)為延胡索總生物堿[10-13]，其中，延胡索乙素行氣、鎮(zhèn)痛作用尤為突出，經(jīng)醋制后延胡索多種生物堿含量均有不同程度地提高[14]，延胡索乙素的穩(wěn)定性也增強[15]。為提高有效物質(zhì)的浸出率，提取前取適量延胡索飲片，加適量醋拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)炒至醋全部吸收，取出，放涼備用。

2.1.1 連續(xù)回流提取 稱取當歸、桂枝經(jīng)提取后的干燥藥渣粉末5 g、雞血藤2.5 g、延胡索5 g，用一定體積分數(shù)的乙醇浸泡至透心，補足吸水率，進行連續(xù)回流提取。

2.1.2 加熱回流提取 準確稱取當歸、桂枝經(jīng)提取后的干燥藥渣粉末5 g、雞血藤2.5 g、延胡索5 g，用一定體積分數(shù)的乙醇浸泡至透心，補足吸水率，進行加熱回流提取。

2.1.3 水煎煮提取 準確稱取當歸、桂枝經(jīng)提取后的干燥藥渣粉末5 g、雞血藤2.5 g、延胡索5 g，加蒸餾水浸泡至透心，補足吸水率，進行水煎煮法提取。

2.2 含量測定

2.2.1 延胡索乙素含量測定

2.2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 waters C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)，乙腈-磷酸三乙胺水溶液(每1000 ml水加1 ml磷酸，用三乙胺調(diào)pH值為6.0)(41∶59)為流動相；檢測波長280 nm，進樣量為20 μl。

2.2.1.2 對照品溶液配制 取適量延胡索乙素對照品，甲醇定容，配制383.2 μg·ml-1的對照品溶液。

2.2.1.3 供試品溶液配制及含量測定 精密吸取“2.1”項下三種樣品液各1 ml，甲醇稀釋，0.45 μm濾膜濾過，進樣，計算延胡索乙素含量及提取率。提取率=提取液中延胡索乙素含量/延胡索飲片質(zhì)量。

A.連續(xù)回流提??；B.水煎煮提取；C.熱回流提取。

2.2.1.4 線性關(guān)系考察 取對照液適量，甲醇定容，配制30.7、61.4、92.1、122.8、184.2 μg·ml-1系列濃度，進樣，定義X為濃度，Y為峰面積作標準曲線，得Y=18 655X-18 172，R2=0.9995 ，于30.7～184.2 μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.5 精密度考察 精密吸取“2.1”項下同批次、同濃度的供試液適量，0.45 μm微孔濾膜過濾，重復(fù)進樣6次，記錄色譜峰面積，經(jīng)計算得RSD為0.31%。

2.2.1.6 穩(wěn)定性考察 精密吸取“2.1”項下同批次、同濃度的供試液適量，于制備后第0、2、4、6、8、12、18、24 h進樣，記錄峰面積，經(jīng)計算得RSD=0.88%。這說明，供試液于該時段內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.7 重復(fù)性試驗 按照“2.1.1”項下方法制做供試液6份，進樣，計算延胡索乙素含量，RSD=1.46%。

2.2.1.8 加樣回收率實驗 精密稱取樣品粉末12.5 g，共6份，每份加入等同于樣品含量的延胡索乙素對照品，按“2.1.1”項下同法制備供試液，進樣經(jīng)計算得平均回收率為99.45%，RSD=1.75%。

2.2.2 延胡索總生物堿含量測定[16]

2.2.2.1 對照品溶液制備 取適量延胡索乙素對照品，pH值為4.5的醋酸-醋酸鈉溶液定容，配制320 μg·ml-1對照液。

2.2.2.2 顯色方法及檢測波長的測定 取10 ml三氯甲烷于分液漏斗，依次加入對照液0.3 ml、醋酸-醋酸鈉溶液0.7 ml、溴甲酚綠溶液4 ml，振搖至有機層顏色不再加深，靜置40 min，取有機層進行全波掃描[8]，得最大吸收波長為410 nm。

2.2.2.3 標準曲線繪制 分別配制0.00、2.56、5.12、10.24、12.8、20.48 μg·ml-1系列濃度的對照液，測吸光度，定義X為進樣濃度，Y為吸光度作標準曲線，得Y=0.043 0X-0.0655，R2=0.999 8，于2.56 ～12.80 μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2.4 供試液含量測定 分別精密吸取“2.1”項下的三種提取液并適當稀釋，按“2.2.2.3”項下操作，計算含量。

2.2.3 雞血藤總黃酮含量測定

2.2.3.1 對照品溶液制備 取適量蘆丁對照品，60%乙醇溶液定容，配制204.8 μg·ml-1對照液。

2.2.3.2 檢測波長的確定[17]取對照液適量，用亞硝酸鈉-硝酸鋁法顯色。以60%乙醇溶液作空白對照，全波長掃描，測得最大吸收波長為490 nm。

2.2.3.3 標準曲線繪制 吸取蘆丁對照液0.0、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0 ml于6只25 ml容量瓶，按“2.2.3.2”項下操作測吸光度，定義濃度為X、吸光度值為Y作標準曲線，得Y=0.012X-0.005，R2=0.999 5，于8.192 ～57.344 μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

采用營養(yǎng)缽育苗，營養(yǎng)缽直徑8厘米、高10厘米，每缽播1粒種子，播后蓋上厚0.5～1厘米的基質(zhì)，每畝大田需備營養(yǎng)缽約2500個。當出苗率達50%時，春季及時揭除營養(yǎng)缽上塑料薄膜，夏秋季通過開關(guān)通風口、開合遮陽網(wǎng)，合理調(diào)節(jié)棚室溫度，保持23℃左右。及時做好調(diào)水、通風、換氣工作。

2.2.3.4 供試液含量測定 吸取“2.1”項下三種提取液并稀釋，按“2.2.3.2”項下操作，計算雞血藤總黃酮含量。

2.2.4 干浸膏得率的測定 取“2.1”項下三種提取液各30 ml，干燥至質(zhì)量恒定，計算干浸膏得率。干浸膏得率=mV∕(30M)×100%。M為干浸膏質(zhì)量，V為提取液總體積，M為飲片總質(zhì)量。

2.3 模糊層次分析法建立指標評價體系 根據(jù)前期試驗結(jié)果，確定延胡索總生物堿提取率、延胡索乙素提取率、雞血藤總黃酮提取率、干浸膏得率為檢測指標。建立多層次遞階結(jié)構(gòu)模型 確定最優(yōu)提取工藝為目標層(O)，有效成分提取率為指標層(X)，延胡索乙素提取率(Y1)，延胡索總生物堿提取率(Y2)，雞血藤總黃酮提取率(Y3)，干浸膏得率(Y4)為方案層。

構(gòu)造正互補判斷矩陣 根據(jù)1-9標度法構(gòu)建方案層(X)對于準則層(Y)的正互補判斷矩陣A=

模糊層次總排序W=W(3)×W(2)，其中W(2)即指標層對目標層的排序向量，本實驗中指標層為有效成分提取率，W(2)=[1]，復(fù)方延胡索微乳凝膠貼膏最優(yōu)提取工藝評價模W=0.288x1+0.271x2+0.238x3+0.204x4型，其中x1為延胡索乙素提取率，x2為延胡索總生物堿提取率，x3為雞血藤總黃酮提取率，x4為干浸膏得率。

2.4 提取方式的優(yōu)化 以提取時間、溶劑倍數(shù)、溶劑體積分數(shù)、浸泡時間為考察對象，延胡索乙素、延胡索總生物堿、雞血藤總黃酮提取率和出膏率為指標進行單因素考察。

2.4.1 單因素試驗 以延胡索乙素、延胡索總生物堿、雞血藤總黃酮提取率和干浸膏得率為評價指標，考察提取時間(A)、溶劑倍數(shù)(B)、乙醇體積分數(shù)(C)、浸泡時間(D)的高低水平。

2.4.2 星點設(shè)計優(yōu)化 提取工藝采用3因素3水平的星點設(shè)計優(yōu)化提取工藝。

2.4.3 抗炎、鎮(zhèn)痛作用研究

2.4.3.1 鎮(zhèn)痛作用研究 50 只小鼠雌雄各半，隨機分成模型對照組(30%乙醇溶液)，地塞米松注射液組，用30%乙醇溶液制成的提取物低、中、高劑量組(生藥1.5、2.4、19.2 g·kg-1)，將各小鼠于實驗前24 h剃除腹毛，每天固定時間經(jīng)皮給藥2次，共5 d。于第5天用藥后20 min均腹腔注射0.6%乙酸0.2 mL/只，觀察并記錄注射后20 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)[8]。

2.4.3.2 抗炎作用研究 50 只小鼠雌雄各半，隨機分成模型對照組(30%乙醇溶液)，地塞米松注射液組，用30%乙醇溶液制成提取物低、中、高劑量組(生藥1.5、2.4、19.2 g·kg-1)，分別于每天固定時間在各組小鼠右耳均勻涂抹相應(yīng)藥物，每天2次，共5天，于最后一次用藥后20 min，在每只小鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)涂抹20 μL二甲苯，40 min后處死，沿耳廓剪下雙耳，用打孔器分別在左右耳相同部位打下同樣大小的耳片，稱重，計算腫脹度和腫脹抑制率[9]。

3 結(jié)果

2.1 提取方式的優(yōu)選 由表1可知，三種提取方式中，連續(xù)回流提取法所得綜合評分值最高，與熱回流提取法相比，該法溶劑消耗更少，提取效率更高。水煎煮提取法綜合評分值最低。最佳提取方式為連續(xù)回流提取法。

表1 三種提取方式的比較

2.2 單因素實驗 各指標在提取4～6 h內(nèi)均處于較高水平，因此應(yīng)選擇提取時間為6、4 h。同理，確定溶劑倍數(shù)為22、18倍，乙醇體積分數(shù)為80%、60%。浸泡時間對延胡索乙素、總生物堿、雞血藤總黃酮提取率的影響不顯著。干浸膏得率隨著浸泡時間的延長先增大后減少。綜合考慮時間成本等因素，確定浸泡時間為0 min(圖2)。

1.延胡索乙素提取率；2.延胡索總生物堿提取率；3.雞血藤總黃酮提取率；4. 干浸膏得率。

2.3 醇提工藝的優(yōu)化 利用星點設(shè)計進行醇提工藝優(yōu)化，因素水平設(shè)置及實驗結(jié)果見表2、3。

表2 星點設(shè)計實驗因素水平

表3 Box-Behnken設(shè)計實驗結(jié)果

運用design expert.V8.0.6對提取時間(A)、溶劑倍數(shù)(B)、乙醇體積分數(shù)(C)進行回歸擬合：Y=-110.9+13.79A+4.848B+1.054C-0.016 25AB-0.002 275AC+0.000 687 5BC-1.291A2-0.116 1B2-0.007 756C2。

根據(jù)方差分析結(jié)果(表4)，失擬項(P=0.078 44>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義，R2=0.995 5，Radj2=0.989 8，說明該模型對本實驗的擬合度較高，與實際實驗數(shù)值誤差小，可解釋98.98%響應(yīng)值的變化，因此可作為模型準確預(yù)測各評價指標的數(shù)值。通過比較F值，各考察指標對綜合評分值影響能力由大到小為：A(提取時間)>B(溶劑倍數(shù))>C(乙醇體積分數(shù))。

表4 回歸模型方差分析

以各考察因素為響應(yīng)因子，綜合評分值為響應(yīng)值繪制曲線圖與等高線圖(圖3)，曲面圖越陡峭，等高線越密集，相應(yīng)兩因素的交互作用對綜合評分值的影響越大。通過對二項式回歸模型的分析預(yù)測結(jié)合實際得出最優(yōu)提取工藝：加入21倍68 %的乙醇，連續(xù)回流提取5 h，此條件下的綜合評分預(yù)測值W=9.637。

A. 提取時間；B.溶劑倍數(shù)；C.乙醇體積分數(shù)。

表5 驗證性實驗

3.4 鎮(zhèn)痛實驗 云南白藥膏組、提取物低、中、高劑量組小鼠扭體次數(shù)比模型對照組少，這表明，提取物有一定的鎮(zhèn)痛作用，且在一定范圍內(nèi)隨著濃度增大，鎮(zhèn)痛作用增強(表6)。

表6 扭體法實驗結(jié)果

3.5 抗炎作用實驗 提取物低、中、高劑量組和云南白藥膏組小鼠均比模型對照組的耳腫脹率低，這表明，提取物有一定的抗炎作用，且在一定范圍內(nèi)隨著濃度增大，抗炎作用增強(表7)。

表7 二甲苯致耳腫脹實驗結(jié)果

4 討論

本研究考察了醇提、水提兩種提取方式對延胡索乙素、延胡索總生物堿、雞血藤總黃酮提取率的影響，實驗結(jié)果表明，三者提取率由高到低依次為：連續(xù)回流提取>熱回流提取>水煎煮提取，連續(xù)回流提取的效率最高，目標物質(zhì)在一定比例的乙醇水溶液中溶解度較高。

黃酮類化合物分子中的3-羥基、5-羥基或鄰二酚羥基易與金屬鹽反應(yīng)，生成有色金屬絡(luò)合物，通過比色法可測得總黃酮含量[18-20]。黃紅泓等[21]在采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定雞血藤總黃酮時發(fā)現(xiàn)，雞血藤陰性提取液呈淡紅色，這提示，除雞血藤外，其他藥物在提取過程中也釋放出少量黃酮類物質(zhì)。因此，在測定雞血藤總黃酮含量時，以雞血藤陰性溶液代替空白溶劑作參照物更為精確。

模糊層次分析法(fuzzy analysis hierarchy process，F(xiàn)AHP)是由20世紀70年代美國運籌學教授T.L.Saaty提出的系統(tǒng)性分析方法。FAHP是一種實用性很強的決策方法，它將模糊綜合評價法的包容性與層次分析法定量性和客觀性的優(yōu)點有機融合，將與決策相關(guān)的因素分為目標層、準則層、方案層，構(gòu)造模糊判斷矩陣，并通過一致性檢驗確定合理性，得出權(quán)重值，計算各方案綜合評分值來確定優(yōu)劣次序。FAHP既考慮主觀性，又兼顧各指標實驗數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，為中藥提取工藝的優(yōu)化提供了新的思路和方法[22-23]。

綜上所述，優(yōu)化后的提取工藝操作簡單、穩(wěn)定可靠，提取物具有良好的鎮(zhèn)痛抗炎藥效，為復(fù)方延胡索微乳凝膠貼膏的制劑開發(fā)提供了思路。