黃荔豐 鐘 偉

漳州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 福建 漳州 363000

ω-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFAs)在促進(jìn)健康和降低疾病風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮著各種作用。ω-3 PUFAs包括α-亞麻酸、硬脂酸、二十碳五烯酸、二十碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)[1]。DHA/EPA等ω-3 PUFAs可以降低結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)風(fēng)險(xiǎn)、抑制轉(zhuǎn)移以及降低抗腫瘤藥物的毒性等有益作用。然而，也有文獻(xiàn)[2]報(bào)道ω-3 PUFAs對(duì)于CRC沒(méi)有效果甚至具有反作用。因此，進(jìn)一步了解ω-3PUFAs的抗炎抗癌作用分子機(jī)制有助于闡明其潛在的健康促進(jìn)作用，為其使用注意事項(xiàng)提供科學(xué)依據(jù)。

富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5，Lgr5)是結(jié)腸干細(xì)胞的重要標(biāo)志蛋白[3]。單純的靶向Lgr5+結(jié)腸癌干細(xì)胞只能達(dá)到暫時(shí)抑制腫瘤的效果，而一旦停止靶向腫瘤干細(xì)胞，周圍細(xì)胞則可能通過(guò)腫瘤炎性微環(huán)境的影響補(bǔ)充結(jié)腸癌干細(xì)胞，使得腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)[4-5]。找到同時(shí)具有抑制直腸癌干細(xì)胞又有抗炎抑制炎性微環(huán)境對(duì)直腸癌細(xì)胞的去分化作用的雙重功能的藥物具有重要意義。DHA不僅具有抗炎的作用，也有治療腫瘤的效果。因此，本研究旨在通過(guò)TNF-α模擬炎性微環(huán)境，探討DHA對(duì)直腸癌細(xì)胞的雙重作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與器材 L-15細(xì)胞培養(yǎng)液和0.5%胰酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自GEMINI公司；兔抗人LGR5(ab75850)、cyclin D1(ab134175)抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗人p65(8242S)、p-p65(3033S)、β-actin(3700S)抗體購(gòu)自CellSignaling Technology公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Promega公司；TNF-α重組蛋白購(gòu)自PeproTech公司。DHA購(gòu)自Sigma公司。DHA 以無(wú)水乙醇配制成濃度100 mol/ml的貯存液，-70 ℃避光保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人直腸腺癌細(xì)胞株SW480和SW620來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中，置于37℃、100%空氣條件下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480和SW620細(xì)胞，以104個(gè)/孔接種于96孔板，加入DHA，使終濃度分別為0、25、50、100 mol/L，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)平行孔。于37℃、100%空氣條件下別培養(yǎng)20 h，加入20 L MTT 溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，小心吸去上清液，加入150 L DMSO，室溫?fù)u床孵育10 min，然后使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度。

1.2.3 熒光定量PCR 直腸癌細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后，以磁珠法提取總RNA。用以上提取的總RNA作為模板，采用Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以cDNA為模板，采用熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明配制PCR反應(yīng)體系，用ABI 公司QuantStudio3儀器進(jìn)行 Real-time qPCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為，95℃預(yù)變性2 min，然后95℃15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，建立溶解曲線。目的基因的表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參照的變化倍數(shù)用2-ΔΔCt表示，以GAPDH為內(nèi)參照基因。

1.2.4 克隆形成試驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞用胰酶消化后稀釋成細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N于6孔板培養(yǎng)皿中(約500個(gè)細(xì)胞/孔)，待細(xì)胞貼壁后加DHA或TNF-α處理24 h。2周后終止培養(yǎng)，PBS清洗后用多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，雙蒸水沖洗，晾干。計(jì)數(shù)克隆數(shù)量(>50個(gè)細(xì)胞/克隆)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，并測(cè)定蛋白濃度，取20～30 g蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入一抗(Lgr5, 1∶500；p65, 1∶2 000；p-p65，1∶2 000；β-catenin，1∶2 000；Cyclin D1，1∶20 000; β-actin，1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌3次，然后加入HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌3次，ECL 顯影。顯影結(jié)果經(jīng)Image J 軟件分析條帶灰度。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 直腸癌細(xì)胞株中Lgr5的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況 本研究采用Real-time qPCR和Western blot法檢測(cè)人直腸癌細(xì)胞系SW480、SW620、RKO和HCT116細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)志Lgr5的表達(dá)，結(jié)果顯示，SW620細(xì)胞中Lgr5的mRNA和蛋白表達(dá)水平均相對(duì)較高(圖1)。

A.Real-time qPCR法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Lgr5 的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平；B.Lgr5 的RT-PCR半定量結(jié)果；C. Western blot法檢測(cè)直腸癌細(xì)胞中Lgr5的蛋白表達(dá)。

2.2 DHA對(duì)直腸癌細(xì)胞的作用 本研究使用不同濃度的DHA(25、50、100 mol/L)分別處理直腸癌細(xì)胞SW480和SW620 24 h，采用MTT法分析DHA作用直腸癌細(xì)胞后的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，隨著DHA濃度的增加，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯下降，50和100 mol/L的DHA對(duì)兩株直腸癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制效果(圖2A)。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DHA以劑量依賴方式抑制了直腸癌細(xì)胞的克隆形成能力(圖 2B)。

A. DHA對(duì)直腸癌細(xì)胞活力的作用；B. DHA對(duì)直腸癌細(xì)胞克隆形成能力的作用。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

本研究使用0、25、50 mol/L的DHA分別處理直腸癌細(xì)胞SW480和SW620 24 h后，通過(guò)Real-time qPCR檢測(cè)Lgr5及Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因β-catenin及Survivin的轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示，50 mol/L的DHA可以抑制兩株細(xì)胞Lgr5的轉(zhuǎn)錄(P<0.05)，可以抑制SW620細(xì)胞的β-catenin(P<0.05)及Survivin(P<0.01)的轉(zhuǎn)錄(圖3)。

A. DHA對(duì)SW480細(xì)胞Lgr5及wnt/β-catenin通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響；B. DHA對(duì)SW620細(xì)胞Lgr5及wnt/β-catenin通路相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 炎性微環(huán)境下DHA對(duì)直腸癌細(xì)胞Lgr5及wnt/β-catenin通路的影響 本研究以25、50 mol/L的TNF-α分別刺激直腸癌細(xì)胞株SW480和SW620 24 h，結(jié)果顯示，NF-κB通路p65的磷酸化水平升高，Lgr5表達(dá)增加(圖4)。25、50 mol/L的TNF-α分別使Lgr5的表達(dá)增加了2.8倍(P<0.05)和3.4倍(P<0.01)。

本研究用TNF-α(50 mol/L)和DHA(50 mol/L)分別或共同作用于直腸癌細(xì)胞，觀察在炎癥環(huán)境下DHA對(duì)直腸癌細(xì)胞的作用。Westernblot結(jié)果顯示，TNF-α促進(jìn)直腸癌細(xì)胞p65的磷酸化，上調(diào)Lgr5的表達(dá)(P<0.05)。經(jīng)DHA處理后，與TNF-α組比較，TNF-α+DHA組的Lgr5表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)(圖5)。

3 討論

隨著對(duì)腫瘤研究的深入，有學(xué)者提出，腫瘤起源于少數(shù)具有自我更新能力和多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)[6]。CSCs被認(rèn)為是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)細(xì)胞力量，靶向腫瘤干細(xì)胞可能是抗腫瘤治療的重要方式[5]。近年來(lái)對(duì)結(jié)腸癌的研究已有較大進(jìn)展。炎性免疫細(xì)胞亞群的功能、結(jié)直腸癌干細(xì)胞的存在、腸道菌群失衡等都是結(jié)腸癌進(jìn)展的重要因素[3, 7- 8]。在慢性炎癥及結(jié)腸癌微環(huán)境中，這些因素緊密聯(lián)系，相互作用，共同形成了影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。

A.TNF-α對(duì)直腸癌細(xì)胞NF-κB通路的激活及Lgr5表達(dá)的影響的免疫印跡圖；B～C.蛋白相對(duì)定量分析結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

A.免疫印跡圖結(jié)果；B～C.蛋白相對(duì)定量分析結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與TNF-α組比較，#P<0.05。

鑒定結(jié)腸癌干細(xì)胞的潛在靶點(diǎn)、相關(guān)信號(hào)通路以及理解周圍的微環(huán)境可能為我們提供更有效的早期診斷方法和相應(yīng)的治療方案。單純的靶向Lgr5+結(jié)直腸癌干細(xì)胞只能達(dá)到暫時(shí)抑制腫瘤的效果，而一旦停止靶向腫瘤干細(xì)胞，周圍細(xì)胞則可能通過(guò)腫瘤微環(huán)境的影響補(bǔ)充腸癌干細(xì)胞，使得腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)[4-5]。因此，找到同時(shí)具有抑制結(jié)直腸癌干細(xì)胞又有抗炎抑制炎性微環(huán)境對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的去分化作用，使結(jié)直腸干細(xì)胞得不到補(bǔ)充的方案將會(huì)有一石二鳥(niǎo)的效果[9]。

DHA可以抑制乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的Wnt/β-Catenin通路[10-12]，抑制NF-κB信號(hào)通路，具有抗炎和預(yù)防腫瘤發(fā)生的作用[13-14]。SW480和SW620來(lái)源于同一直腸腺癌患者的原位腫瘤細(xì)胞(SW480)以及一年后發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞(SW620)。兩者都是高度惡性的直腸癌細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)移細(xì)胞瘤細(xì)胞株SW620較SW480表達(dá)更高的Lgr5。這提示，Lgr5的表達(dá)可能與腫瘤的惡性程度有關(guān)。在體外培養(yǎng)的條件下，炎性因子TNF-α可以激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志蛋白Lgr5的表達(dá)。這說(shuō)明，炎性微環(huán)境可能促進(jìn)結(jié)腸癌干細(xì)胞的表型。DHA可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的克隆形成能力。Fluckiger等[15]發(fā)現(xiàn)，DHA可以通過(guò)促進(jìn)TNF-α的自分泌的方式誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是DHA促進(jìn)了Foxo3a核內(nèi)累積，并結(jié)合到miR-21啟動(dòng)子區(qū)，抑制miR-21的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致結(jié)合TNF-α mRNA反應(yīng)性上調(diào)，最終促進(jìn)了TNF-α的表達(dá)和自分泌，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。而本研究表明，DHA可以抑制TNF-α的轉(zhuǎn)錄，并在一定程度上抑制TNF-α激活的炎癥信號(hào)通路，抑制wnt/β-catenin信號(hào)通路及Lgr5的表達(dá)。原因可能是因?yàn)榧?xì)胞株不同，本研究的兩株細(xì)胞Lgr5的表達(dá)水平也相對(duì)于HCT-116要高。此外，DHA處理的濃度差異也可能與此相關(guān)。結(jié)腸干細(xì)胞受wnt通路調(diào)節(jié)，可通過(guò)wnt通路調(diào)節(jié)Lgr5陽(yáng)性干細(xì)胞的數(shù)量[16]。總之，DHA在一定程度上既可能抑制Lgr5+直腸癌干細(xì)胞，也可能抑制了直腸癌細(xì)胞的去分化，達(dá)到雙重的效果。

在誘導(dǎo)DNA損傷后，Lgr5+干細(xì)胞對(duì)外部飲食因素(聯(lián)合DHA和姜黃素)具有獨(dú)特的反應(yīng)，這為消除受損Lgr5+干細(xì)胞，降低腫瘤發(fā)生提供了潛在治療策略[17]。一項(xiàng)meta分析納入11項(xiàng)研究顯示，短期服用omega-3 PUFA可降低結(jié)直腸癌術(shù)后感染并發(fā)癥、炎癥因子和住院時(shí)間[18]。然而，也有meta分析報(bào)道，與不含n-3 PUFAs的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)相比，富含n-3 PUFAs的腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)對(duì)胃腸道腫瘤患者術(shù)后恢復(fù)期的營(yíng)養(yǎng)狀況、肺炎和傷口感染的發(fā)生率無(wú)顯著影響[19]。本研究?jī)H從細(xì)胞水平上探索了DHA在模擬炎性環(huán)境下對(duì)于直腸癌的作用，炎性微環(huán)境如何促進(jìn)Lgr5+直腸癌CSCs的補(bǔ)充，DHA在體內(nèi)腫瘤炎性微環(huán)境對(duì)腫瘤干細(xì)胞的具體作用及機(jī)制還需要更多系統(tǒng)和深入的研究。

綜上所述，DHA可以抑制直腸癌細(xì)胞增殖，抑制直腸癌細(xì)胞的克隆形成能力。DHA在一定程度上抑制TNF-α激活的炎癥信號(hào)通路，抑制wnt/β-catenin信號(hào)通路及Lgr5的表達(dá)。DHA具有潛在抑制Lgr5+直腸癌干細(xì)胞增殖和直腸癌細(xì)胞去分化為干細(xì)胞的雙重效果。本研究為靶向直腸癌干細(xì)胞治療方法提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為臨床上腫瘤的抗炎輔助治療提供新的理論支撐。