徐琪鈞 劉秀珍 張肖林 尹晶晶 李長(zhǎng)葉 劉雪華 王延飛

1 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 山東 濱州 256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室 山東 濱州 256603

聽(tīng)力損失是世界上排名第四位的致殘性疾病[1]，世界總?cè)丝诘?%～8%都有不同程度的聽(tīng)力損失，老年人口中患有聽(tīng)力損失的比例高達(dá)70%[2]。聽(tīng)力損失不僅影響人們之間的溝通，而且會(huì)造成患者智力、認(rèn)知水平的下降。有研究表明，年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失與阿爾茲海默癥相關(guān)[3]。大多數(shù)聽(tīng)力損失為感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失，其病因?yàn)槎伱?xì)胞及其神經(jīng)細(xì)胞或血管紋及支持細(xì)胞的功能損傷，發(fā)病影響因素為耳聾基因的突變、衰老、耳毒性藥物的使用、耳蝸慢性感染及噪音暴露等[4]。目前，聽(tīng)力損失具體的機(jī)制尚不完全清楚。已有研究表明，氧化應(yīng)激、線粒體損傷、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等可能參與了聽(tīng)力損失的發(fā)生;另外，炎癥也是聽(tīng)力損失的一種潛在機(jī)制，尤其是在年齡相關(guān)性、耳蝸慢性感染以及噪音暴露導(dǎo)致的聽(tīng)力損失中占有重要的地位。本研究通過(guò)向C57BL/6J 小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘發(fā)急性炎癥反應(yīng)，觀察小鼠的聽(tīng)力變化并分析其相關(guān)機(jī)制，以便為治療耳聾提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠 30只2月齡C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量為15～18 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院清潔級(jí)動(dòng)物房，相對(duì)濕度為45%～55%，每天光照12 h。本研究所涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均獲濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)為20210808-07)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 SmartEP&OAE聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位系統(tǒng)(美國(guó)Intelligent Hearing Systems公司)；低溫高速離心機(jī)及高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；電子天平稱【梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司】；微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；CX21型普通光學(xué)微顯鏡(日本奧林巴斯公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；粘附載玻片及顯微鏡蓋玻片(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)；富勒姆超純水機(jī)(青島富勒姆科技有限公司)；蘇木素、伊紅溶液【上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)公司(IH-017A、IH018A)】；LPS(美國(guó)sigma公司，No.為L(zhǎng)2880)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠分組及處理 將30只2月齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白組、LPS組及對(duì)照組，每組10只?？瞻捉M不加處理，LPS組小鼠以腹腔注射的方式予以2.5 mg/kg的LPS，對(duì)照組以相同注射方法輸注相等體積的生理鹽水。各組的生活條件保持一致。

1.2.2 聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory stem response，ABR)測(cè)量 造模3、7、15 d后給予小鼠4%水合氯醛麻醉后置于恒溫墊上維持體溫為37～38℃，分別將記錄電極、參考電極及接地電極插入小鼠測(cè)試耳后、頭頂、對(duì)側(cè)耳皮下。SmartEP&OAE聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行click、8、16、32 kHz頻率刺激，掃描時(shí)程為10 ms，疊加1 024次。聲強(qiáng)刺激先以80 dB SPL開(kāi)始，逐漸以10 dB SPL遞減，至無(wú)明顯II波時(shí)向上遞增5 dB SPL，以II波消失處為ABR閾值。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 造模3 d后，每組取4只小鼠，摘除眼球取血，室溫下靜置1 h,以3 000 rpm/min離心10 min備用。從4℃冰箱內(nèi)取出欣博盛酶聯(lián)免疫試劑盒在室溫下復(fù)溫20 min，按照說(shuō)明書配置梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次進(jìn)行加樣、孵育、生物素化抗體結(jié)合、孵育、酶結(jié)合物結(jié)合、孵育、顯色、孵育、終止顯色等步驟，使用酶標(biāo)儀測(cè)量樣本的OD值。

1.2.4 耳蝸冰凍切片HE染色 以上4只小鼠取血后處死，取其右側(cè)耳蝸用4%多聚甲醛溶液(pH值為7.4)4℃固定24 h，EDTA脫鈣液脫鈣處理7 d后，經(jīng)OCT包埋劑包埋，常規(guī)冰凍切片，切片厚度為5 μm，蘇木素-伊紅染色，光鏡觀察。

1.2.5 飲水飲食、體質(zhì)量測(cè)定 在實(shí)驗(yàn)前測(cè)量小鼠體質(zhì)量，注射LPS 3、7、15 d后進(jìn)行體質(zhì)量和飲水飲食測(cè)量，其中飲食飲水需要中間補(bǔ)充，稱重。最后飲食飲水進(jìn)行數(shù)量及體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 注射LPS(2.5 mg/kg)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠聽(tīng)力損失 空白組、LPS組及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前初始ABR閾值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？瞻捉M與對(duì)照組在注射3、7、15 d后，在8、16和32 kHz頻率下聽(tīng)力無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，LPS組在注射3 d后在16和32 kHz頻率下的聽(tīng)力閾值均明顯升高，P<0.05。在注射7 d后兩組聽(tīng)力閾值變化趨勢(shì)和注射3 d后的趨勢(shì)大致相同，LPS組的聽(tīng)力閾值均升高(16 kHz，P=0.038)和(32 kHz，P=0.046)。在注射15 d后，兩組聽(tīng)力閾值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余頻率下閾值變化不明顯(圖1)。

對(duì)照組與LPS組比較，*P<0.05。

2.2 注射LPS(2.5 mg/kg)誘發(fā)C57BL/6J小鼠急性炎癥 LPS組在注射3 d后的聽(tīng)力閾值升高，P<0.05。然后，本研究探測(cè)其血清炎癥因子變化。本研究運(yùn)用ELASA方法檢測(cè)到，LPS組TNF-α，IL-6及NF-κB血清水平均高于對(duì)照組，P<0.05，但I(xiàn)L-1β無(wú)明顯變化(圖2)。這說(shuō)明，注射LPS誘發(fā)C57BL/6J小鼠急性炎癥，體內(nèi)炎癥因子升高，這可能是造成聽(tīng)力損失的機(jī)制之一。

*P<0.05。

2.3 注射LPS(2.5 mg/kg)誘發(fā)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋的形態(tài)學(xué)變化 LPS組在注射3 d后聽(tīng)力閾值升高，P<0.05，且體內(nèi)血清炎癥因子表達(dá)升高(圖3)。本研究猜測(cè)，炎癥因子的升高會(huì)通過(guò)血腦屏障進(jìn)入耳蝸，從而造成耳蝸組織的某種變化，導(dǎo)致聽(tīng)力損失。于是，本研究對(duì)此進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，LPS組的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)的形態(tài)破壞，這可能是急性炎癥造成聽(tīng)力損失的原因之一。

2.4 注射LPS不影響小鼠的代謝過(guò)程 LPS組在注射3 d后的聽(tīng)力閾值升高。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，LPS組的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失，血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)的形態(tài)破壞，血管紋空泡化，所以有理由檢測(cè)小鼠的基本代謝過(guò)程，以排除LPS造成機(jī)體副作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS不能影響小鼠的飲食、飲水及體質(zhì)量(圖4)。LPS(2.5 mg/kg)劑量可以引發(fā)急性炎癥，但因?yàn)锳BR及代謝指標(biāo)在注射15 d后都趨于正常，所以推斷，小鼠在注射15 d后能很快恢復(fù)到原始狀態(tài)。

圖4 兩組在注射LPS 3、7、15 d后的飲水飲食及體質(zhì)量變化

圖3 兩組在注射LPS 3 d后的耳蝸組織染色圖像

3 討論

聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)是生物體的重要感官之一，其在獲得外界聲音、語(yǔ)言和聽(tīng)覺(jué)技能方面至關(guān)重要。聽(tīng)力損失會(huì)讓患者處于多年的致殘狀態(tài)，與外界交流不便，嚴(yán)重者甚至無(wú)法溝通。聽(tīng)力損失的發(fā)病率隨著年齡的增加而增長(zhǎng)[5-6]。其精確的作用機(jī)制尚不明確。多種炎性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞都可以浸潤(rùn)到耳蝸的螺旋韌帶與血管紋處，其異常調(diào)節(jié)可導(dǎo)致聽(tīng)力損失[7-8]。

C57BL/6J近交系小鼠具有進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失的特點(diǎn)，且具有與人類年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失相似的表觀現(xiàn)象，7月齡開(kāi)始出現(xiàn)耳聾，12月齡可達(dá)到中度耳聾，是比較成熟的漸進(jìn)性聽(tīng)力損失的動(dòng)物模型之一[9]。2～3月齡是誘導(dǎo)C57BL/6J近交系小鼠炎癥及其他模型的最佳時(shí)機(jī)。

LPS是一種在大多數(shù)革蘭氏陰性菌的外膜中存在的與致病相關(guān)的分子，其可引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，是理想的炎癥模型制劑。在對(duì)小鼠炎癥反應(yīng)或氧化應(yīng)激的研究中，LPS的注射劑量由1～100 mg/kg不等，其中使用較多的劑量為1～10 mg/kg，其中因副作用較少，2.5 mg/kg較為普遍[10-11]。這與本研究觀察到小鼠的體質(zhì)量及飲食飲水不受影響相一致。本研究選擇C57BL/6J雄性小鼠作為研究對(duì)象，以腹腔注射LPS的給藥方式，劑量為2.5 mg/kg，誘發(fā)雄性小鼠的機(jī)體炎癥，來(lái)了解其對(duì)聽(tīng)力的影響。

注射LPS 3、7 d后可以明顯造成小鼠聽(tīng)力損失，這可能和機(jī)體炎癥的發(fā)生有很大關(guān)系。高頻聽(tīng)力損失嚴(yán)重，但低頻無(wú)明顯差異，這與前人的報(bào)道[12]一致。高頻聽(tīng)力損失治療困難[13]，一般治療是擴(kuò)血管，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)為主。高頻聽(tīng)力損失嚴(yán)重，但低頻無(wú)明顯差異這一結(jié)論為臨床工作者提供很好的治療思路，也為聾病患者治療提供理論依據(jù)。LPS組TNFα、IL-6及NF-κB的血清水平明顯高于對(duì)照組。在眾多炎癥細(xì)胞因子中，起主要作用的是TNF-α 、IL-1β、IL-6等。TNF-α是炎癥反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)，能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性，并促使其他細(xì)胞因子的合成和釋放。IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑[14]。在感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失患者的TNF-α水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在常規(guī)治療后，療效不佳的患者血清內(nèi)的TNF-α明顯高于治愈后的患者[15-16]。年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失的患者血清中IL-6的升高可能通過(guò)激活NF-κB導(dǎo)致嚴(yán)重的突發(fā)性感音神經(jīng)性聽(tīng)力損失[17]。IL-1β由活化的單核/巨噬細(xì)胞分泌，作為一種炎癥放大因子在炎癥中起著至關(guān)重要的作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在LPS注射后，NF-κB的表達(dá)水平升高，猜測(cè)耳蝸炎癥的發(fā)生和NF-κB/TNF-α/IL-6通路密切相關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

本研究還觀察了小鼠組織形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，LPS組可導(dǎo)致螺旋神經(jīng)節(jié)丟失及血管紋的破壞，但

是毛細(xì)胞不受影響，這可能與急性炎癥有關(guān)，但在注射15 d后聽(tīng)力恢復(fù)，可能與毛細(xì)胞無(wú)破壞有關(guān)。這說(shuō)明，急性炎癥可造成一過(guò)性損傷，但慢性炎癥會(huì)不會(huì)造成永久性損傷有待進(jìn)一步研究。下一步需要增加時(shí)間節(jié)點(diǎn)，觀察相應(yīng)的耳蝸形態(tài)變化，為耳聾的治療提供依據(jù)。

綜上所述，LPS可誘發(fā)小鼠耳蝸的急性炎癥，造成聽(tīng)力損失，主要表現(xiàn)為高頻聽(tīng)力損失。阻止急性炎癥的發(fā)生可以在某種程度上降低聽(tīng)力損失，為臨床工作者治療耳聾提供新的思路。