孫思駿 賈景丹 李 欣 駱 徐 楊以正 姜文國

1 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 山東 煙臺 264003; 2濱州市人民醫(yī)院 山東 濱州 256600

結(jié)腸癌的發(fā)病率在常見惡性腫瘤中排名第三位，結(jié)腸癌也是第五大常見腫瘤死亡原因。結(jié)腸癌的發(fā)病率增長迅速，5年生存率較低[1]。在確診為結(jié)腸癌時，超過20%的患者已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，結(jié)腸癌的早期診斷和精準靶向治療十分重要。

正常細胞和腫瘤細胞內(nèi)的線粒體參與了能量生成、細胞增殖、凋亡等很多復(fù)雜的生理過程。線粒體功能障礙與多種惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)[2]。線粒體ATP合酶由F0和F1組成，在細胞能量轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用。F1與催化活性有關(guān)，執(zhí)行ADP-ATP催化功能。F1包括α3、β3、γ、δ、ε亞基。ATP5A1和ATP5B分別是指α亞基和β亞基。

目前研究較多的是ATP5B。ATP5B在肺腺癌、前列腺癌等腫瘤細胞中高表達，并促進腫瘤血管生成[3]，而關(guān)于ATP5A1的研究相對較少。ATP5A1與糖尿病、心血管疾病、衰老、阿爾茲海默病、自閉癥以及腫瘤等疾病均有一定的相關(guān)性[4]。ATP5A1在腫瘤細胞和組織中的表達水平和它的臨床意義存在一些矛盾的結(jié)果。大多數(shù)結(jié)直腸癌細胞具有染色體不穩(wěn)定性，ATP5A1的表達降低預(yù)示著不良的臨床結(jié)果[5]。因此，有必要進一步闡明ATP5A1的表達水平改變對結(jié)腸癌的診斷和治療的意義。

本研究采用組織芯片探討ATP5A1表達與結(jié)腸癌患者臨床指標的相關(guān)性，揭示ATP5A1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其與預(yù)后的關(guān)系。本研究在細胞水平對ATP5A1的表達進行干預(yù)，研究細胞功能變化，闡明ATP5A1表達變化、功能變化所影響的信號網(wǎng)絡(luò)，探討干預(yù)ATP5A1表達對結(jié)腸癌靶向治療的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人結(jié)腸癌組織芯片(批號為HColA180Su14)購自于上海芯超生物科技有限公司的產(chǎn)品，包括結(jié)腸腺癌90例，癌/癌旁各1點，手術(shù)時間為2009年1月至2009年10月，隨訪時間為5.7～6.5年。結(jié)腸癌細胞系SW480及采用逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染建立的ATP5A1高表達細胞系SA11由本實驗室長期保存，10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。ATP5A1抗體(產(chǎn)品號為ab176569)購自abcam公司。通用型超敏型二步法免疫組化檢測試劑盒(PV9000)、濃縮型DAB顯色試劑盒(ZLI-9018)均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。CCK-8試劑盒購自北京Solarbio公司。2-Thenoyltrifluoroacetone(TTFA，貨號為M6210)購自AbMole生物技術(shù)公司，Oligomycin A(產(chǎn)品號為579-13-5)購自MCE公司。

1.2 免疫組化及結(jié)果判讀 將組織芯片在60℃烤箱中烘烤2 h，脫蠟，水化，抗原熱修復(fù)，封閉，沖洗后加入ATP5A1抗體(1∶650稀釋)孵育過夜，然后采用中杉金橋公司兩步法免疫組化試劑盒進行檢測，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下，陽性細胞顯示為棕褐色，顯微鏡低倍鏡下照相保存結(jié)果。分別判讀癌組織和癌旁組織中ATP5A1的胞漿染色的染色強度和染色陽性率。染色強度評分為0分(陰性)，1分(1+)，2分(2+)，3分(3+)。染色陽性率評分為0分(陰性)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。以“染色強度評分”和“染色陽性率評分”的乘積為總評分進行分組，≤6分為抗體低表達組，>6分為抗體高表達組。

1.3 生存期分析 對ATP5A1蛋白表達高低和組織芯片患者隨訪生存時間進行生存期分析。從The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中搜索結(jié)腸癌患者數(shù)據(jù)，并下載文件，使用TCGA數(shù)據(jù)庫中341例結(jié)腸癌分析ATP5A1基因表達水平和患者生存時間的相關(guān)性。

1.4 ATP5A1差異表達的細胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析 收集細胞，RIPA裂解液裂解細胞，BCA法蛋白定量后采用膠內(nèi)酶解方法進行蛋白樣品酶解。酶解后的肽段進行LC-MS分析。LC-MS系統(tǒng)包括EASY-nLC 1200的液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive Orbitrap質(zhì)譜系統(tǒng)。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MaxQuant 1.6.12.0在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)檢索鑒定。通過肽段質(zhì)譜峰面積獲得對應(yīng)蛋白相對表達量數(shù)據(jù)。通過組間比較獲得差異蛋白，并進行KEGG通路富集分析。

1.5 CCK-8細胞增殖分析 將指數(shù)生長期的SW480細胞和SA11細胞懸液200 μL接種到96孔培養(yǎng)板中。當細胞附著后，將不同濃度的氧化呼吸鏈復(fù)合物II抑制劑TTFA(0、0.1、1 mM)和ATP合酶抑制劑oligomycin A(0、0.1、1 μM)以換液的方式加入96孔板，每孔加入200 μL并設(shè)置空白對照組，培養(yǎng)48 h。每孔加入110 μL CCK-8試劑混合液(含CCK-8試劑10 μL)，培養(yǎng)2 h，酶標儀在波長450 nm下測OD值。

2 結(jié)果

2.1 ATP5A1在結(jié)腸癌組織的表達 因9例結(jié)腸癌和癌旁組織(7例癌旁、2例結(jié)腸癌)脫片，本研究對組織芯片中可配對的81對結(jié)腸癌和癌旁組織分析發(fā)現(xiàn)，與相應(yīng)癌旁組織比較，ATP5A1在結(jié)腸癌組織中的表達顯著增高(表1)。圖1展示的是正常癌旁組織和結(jié)腸癌組織ATP5A1免疫組化染色代表性圖片，可以看到在結(jié)腸癌組織染色較深，表明ATP5A1在結(jié)腸癌組織表達增高，在正常組織表達較低。

表1 ATP5A1在結(jié)腸癌和相應(yīng)癌旁組織的表達情況

圖1 結(jié)腸癌及癌旁組織中ATP5A1的免疫組化染色圖片(40×)

結(jié)腸癌組中有2例脫片，在未脫片的88例結(jié)腸癌組織中，高表達者54例，低表達者34例。分析對應(yīng)的臨床資料表明，ATP5A1低表達患者多屬于TNM分期中的 III/IV期，出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移較多，并且ATP5A1低表達患者屬于分化較差的高度惡性腫瘤，但ATP5A1表達高低與年齡、性別等因素?zé)o關(guān)(表2)。

表2 結(jié)腸癌中ATP5A1的表達與臨床資料之間的相關(guān)性

2.2 結(jié)腸癌ATP5A1的表達與臨床預(yù)后之間的關(guān)系 本研究將組織芯片中88例結(jié)腸癌患者生存時間按照ATP5A1表達高低分組發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者的ATP5A1高表達預(yù)示著較長時間的生存期(圖2a)。本研究采用TCGA數(shù)據(jù)庫對341例結(jié)腸癌組織中ATP5A1基因表達高低和生存時間分別進行統(tǒng)計學(xué)分析。341例結(jié)腸癌患者中，高表達者163例，低表達者178例。本研究顯示，ATP5A1基因高表達結(jié)腸癌患者同樣表現(xiàn)出較長生存時間，與組織芯片實驗結(jié)果的趨勢一致(圖2b)。這也與患者臨床資料中TNM分期、轉(zhuǎn)移情況、分級情況等相關(guān)參數(shù)相對應(yīng)。

a. 生存期組織芯片分析；b. TCGA數(shù)據(jù)庫分析。

2.3 ATP5A1表達差異影響的信號網(wǎng)絡(luò) 本研究應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對SW480細胞系和SA11細胞系進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)表達1 337種蛋白，其中差異蛋白327種，高表達蛋白202種，低表達蛋白125種(圖3a)。對327種差異蛋白進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，ATP5A1所在的氧化磷酸化功能相關(guān)的信號通路蛋白表達具有顯著性差異(圖3b)。參與氧化磷酸化功能相關(guān)的差異蛋白相對表達量見圖3c。隨著ATP5A1表達增加，參與氧化磷酸化的各復(fù)合物都有不同程度的表達上調(diào)，尤以琥珀酸氧化呼吸鏈復(fù)合物II中的琥珀酸脫氫酶復(fù)合體B亞基(succinate dehydrogenase B，SDHB)表達增高最為顯著。

a. 火山圖分析差異蛋白；b. KEGG分析；c. 氧化磷酸化信號通路蛋白相對表達量。

2.4 SDHB與ATP5A1在結(jié)腸癌細胞增殖中的協(xié)同作用 本研究采用氧化呼吸鏈復(fù)合物II抑制劑TTFA和ATP合酶抑制劑 oligomycin A分別研究其對SW480細胞系和高表達ATP5A1的SA11細胞株增殖能力的影響。與不加抑制劑比較，低表達ATP5A1和SDHB的細胞系中TTFA和oligomycin A均在更大程度上抑制細胞增殖(圖4a、4b)。這表明，高表達的ATP5A1使得結(jié)腸癌細胞獲得了對兩種不同機制抑制劑的抵抗力。

a. TTFA；b. oligomycin A。與不加抑制劑相比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 討論

惡性腫瘤具有獨特的生物能量現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為糖酵解增加及線粒體功能降低，主要體現(xiàn)在線粒體ATP合成酶的表達降低和糖酵解酶的表達增加。ATP5A1是ATP合成酶的主要組分之一，其在不同腫瘤細胞和組織表達變化和功能不一致。在前列腺癌中抑制ATP5A1的表達對腫瘤的治療有益，低表達的患者存活時間較長[6]，而在結(jié)直腸癌中，低表達ATP5A1代表腫瘤耐藥和預(yù)后較差[7]。

大多數(shù)結(jié)直腸癌組織具有染色體不穩(wěn)定性，ATP5A1的表達降低預(yù)示著不良的臨床后果[5]。在耐藥的結(jié)腸癌細胞中，包括ATP5A1亞基在內(nèi)的ATP合酶表達下降，這提示腫瘤對化療藥物耐藥與ATP5A1低表達有關(guān)[7-8]。謝春英等[9]研究發(fā)現(xiàn)，ATP5A1在大腸癌表達水平顯著低于癌旁組織，而王銳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，ATP5A1在大腸癌表達增高，并且ATP5A1的高表達與低分化及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。但以上研究并未區(qū)分結(jié)腸癌和直腸癌。本研究專一研究結(jié)腸癌樣本，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中ATP5A1表達增高顯著，ATP5A1表達高低與年齡、性別等因素?zé)o關(guān)，ATP5A1低表達患者多屬于TNM III/IV期，并容易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，屬于分化較差的高度惡性腫瘤。本研究采用了帶有生存期資料的組織芯片，結(jié)合生存期分析發(fā)現(xiàn)ATP5A1高表達患者預(yù)示著較長時間的生存期，采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析了更多樣本，獲得了與組織芯片一致的實驗結(jié)果。該結(jié)果進一步明確了ATP5A1在結(jié)腸癌的表達水平變化和相關(guān)臨床參數(shù)間的相關(guān)性。

SETH R等[8]檢測了16種不同結(jié)直腸癌細胞系A(chǔ)TP5A1的表達水平，發(fā)現(xiàn)不同細胞系之間表達差異較大，其中SW480最低、CaCo2表達最高，差別達到近10倍。本研究選擇SW480細胞系，利用慢病毒過表達構(gòu)建ATP5A1高表達細胞株SA11，采用高分辨質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)了差異蛋白327種，發(fā)現(xiàn)隨著ATP5A1蛋白組分表達增加，ATP5A1蛋白所在的線粒體氧化磷酸化功能相關(guān)的信號通路蛋白表達均有顯著增加，尤以復(fù)合物II中的SDHB表達增高最明顯，此種現(xiàn)象被稱為線粒體重塑。線粒體重塑使細胞適應(yīng)生長發(fā)育中缺氧等環(huán)境的各種變化和挑戰(zhàn)[11]。

線粒體是相對獨立的細胞器，在細胞代謝和程序性細胞死亡途徑中發(fā)揮重要的作用。線粒體基因、結(jié)構(gòu)和功能的改變與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。線粒體的一些改變會有利于細胞的生長，決定了它們能否在細胞內(nèi)外改變中存活。在腫瘤細胞線粒體存在的一些特異性改變使得它有可能成為腫瘤治療的靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中ATP5A1一種蛋白表達增加，會導(dǎo)致多種線粒體蛋白同時表達增加。這說明了氧化磷酸化呼吸鏈的不同組分間存在協(xié)同變化現(xiàn)象，一種組分的改變會誘導(dǎo)氧化呼吸鏈其他組分的表達和功能的同步變化，出現(xiàn)線粒體重塑現(xiàn)象。

XIAO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體復(fù)合物II中的SDHB下調(diào)有利于結(jié)直腸癌的增殖和遷移，促進糖酵解。SDHB在結(jié)直腸癌組織低表達，與腫瘤分級密切相關(guān)，分化越差，表達越低[13]。ATP5A1誘導(dǎo)所致的SDHB表達增高，意味著結(jié)腸癌細胞中琥珀酸呼吸鏈功能增強。采用氧化呼吸鏈復(fù)合物II抑制劑TTFA和ATP合酶抑制劑 oligomycin A處理結(jié)腸癌細胞，與不加抑制劑相比較，在低表達ATP5A1和SDHB的細胞系發(fā)現(xiàn)TTFA和oligomycin A能更大程度上抑制細胞增殖。這說明，由單一ATP5A1高表達引起的線粒體蛋白組分和功能的變化導(dǎo)致了細胞對兩種不同機制的抑制劑產(chǎn)生了耐受性。因此，這提示在對出現(xiàn)線粒體重塑現(xiàn)象的結(jié)腸癌進行治療時需采用更具針對性的協(xié)同分子靶向治療策略和個性化治療方案。