朱 琪，李秀麗，任衛(wèi)科，江 珊，張 莉，王建國，鄢明華

(天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

魚腥草(houttuynia cordata)作為傳統(tǒng)中獸藥在畜禽生產(chǎn)中應用廣泛，前期研究表明，飼料中添加魚腥草有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、提高生產(chǎn)性能等多重功效，從而達到抗病提高畜禽生產(chǎn)力的目的[1-3]。魚腥草多糖(houttuynia cordata polysaccharide, HCP)是魚腥草中提取的天熱有效成分，其中單糖組成主要為木糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖[4-5]，研究表明其具有廣譜的抗病毒作用，對多種病毒均有不同程度的抑制作用[6-7]。非洲綠猴腎細胞MA104及其單克隆得到的MARC145細胞是多種病毒的宿主，在體外研究中可以作為病毒復制的載體，尤其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)，牛/豬輪狀病毒(bovine/porcine rotavirus, RV)和禽傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus, IBV)等有很好的適應性[8-10]。探明HCP對MA104和MARC145細胞的毒性作用，以期為HCP體外藥理研究提供試驗支撐，為進一步研究其藥理作用機理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 魚腥草多糖的提取與配制 魚腥草購自安國市友鑫中藥材銷售有限公司。

魚腥草除雜、干燥、粉碎過40目篩，準確稱量8 g，加入400 mL純凈水，水浴加熱80 ℃回流提取6 h，重復三次；合并所得過濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮定容至40 mL(得魚腥草水提物)，取20 mL濃縮液加入100 mL 95%乙醇進行醇沉過夜，待第2天有大量醇析物時，棄去上清液后，將醇析物水浴蒸干得魚腥草粗多糖；粗多糖蒸餾水定容至30 mL，加入等量體積的Sevage試劑(氯仿﹕正丁醇=4∶1，體積比) 混合震蕩30 min，離心取上清液，重復3次，多糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖繪制標準曲線，比較得出多糖濃度，計算公式如下：多糖得率=C×V×N/m×100%(C多糖濃度；V藥品測試體積；N稀釋倍數(shù)；m原料藥初始質(zhì)量)。

魚腥草多糖含量的測定：繪制標準曲線，取分析純無水葡萄糖干燥至恒重。精密稱量60 mg，置于100 mL容量瓶中，加水定容，超聲混勻，得葡萄糖對照品溶液。用移液槍取葡萄糖對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于50 mL的容量瓶中，加水定容并超聲混勻，得對照品梯度溶液D1、D2、D3、D4、D5，備用。取對照品梯度溶液D1、D2、D3、D4、D5各2 mL于試管中，各加4%苯酚溶液1 mL混勻再迅速加入硫酸7 mL，搖勻。40 ℃水浴30 min，取出再冰浴5 min。以蒸餾水調(diào)零于490 nm處測定吸光度值，每組平行測定三次，取均值。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，建立標準曲線。多糖含量的測定，方法同上，代入得出的標準曲線方程中，計算濃度以及干燥產(chǎn)物的多糖含量。多糖提取流程圖如圖1所示。

圖1 魚腥草多糖提取流程圖

1.2 細胞來源及培養(yǎng) MA104和MARC145細胞購自ATCC細胞保藏中心。

復蘇細胞：將含有1 mL細胞懸液的凍存管在37 ℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 RPM條件下離心4 min，棄去上清液，補加2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。檢查細胞活力計數(shù)凍存，檢測細胞和相關試劑支原體陰性備用，利用0.4%臺盼藍染色法檢測活細胞率，進行細胞計數(shù)。

細胞生長培養(yǎng)基：DMEM(高糖型，含4500 mg/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110 mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉)+8%胎牛血清+ 1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的培養(yǎng)液，調(diào)pH值為7.4；細胞維持培養(yǎng)基：DMEM+4%胎牛血清；凍存液：細胞生長培養(yǎng)基+10%胎牛血清+10% DMSO；消化液：0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

細胞培養(yǎng)條件：溫度37 ℃；95%空氣；5% CO2；濕度90%以上。細胞傳代培養(yǎng)，復蘇細胞每管接種T25培養(yǎng)瓶一個，細胞在剛長成細胞單層時記錄并及時進行消化傳代。按1∶3傳代，細胞接種密度為1×105cells/mL，觀察記錄長成單層的時間。

1.3 細胞生長曲線的繪制 分別用細胞平板計數(shù)法和MTT法繪制細胞生長曲線：將長成單層的MA104/MARC145細胞從培養(yǎng)瓶內(nèi)消化下來，吹打均勻后按0.5×104個細胞/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中。每天取6孔細胞，消化后計數(shù)并取平均值，連續(xù)監(jiān)測9 d；同時另鋪板用MTT法檢測各孔OD值，以天數(shù)時間為橫坐標，細胞數(shù)/OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.4 魚腥草多糖對細胞活力的影響 根據(jù)細胞生長曲線確定對數(shù)生長期為試驗階段，配制梯度濃度的HCP溶液(0、0.005、0.05、0.5、5、50 mg/mL)，將梯度濃度的HCP溶液孵育細胞24 h，MTT法檢測細胞活力，每孔加MTT溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h。終止培養(yǎng)吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液(100 μL/孔)，室溫下，平板置在微孔板震蕩器上震蕩10 min，使結(jié)晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD值(λ=570 nm)，記錄結(jié)果[11]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”(x±s)表示，以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。圖集均由GraphPad Prism 6.0繪圖軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚腥草多糖提取率 魚腥草原藥提取多糖通過以料液比1∶50，80 ℃熱水回流浸提6 h，5倍乙醇沉淀，Sevage 法除蛋白，真空冷凍干燥獲得。經(jīng)葡萄糖標準曲線檢測多糖濃度C為4.36 mg/mL，根據(jù)公式算得HCP提取率為8.18%。

2.2 細胞生長曲線繪制 由圖2可知，細胞平板計數(shù)法繪制細胞生長曲線圖呈S型，有明顯的潛伏期、對數(shù)生長期和衰退期；MA104細胞峰值出現(xiàn)在第7天，而MARC145細胞峰值為第8天，MA104細胞的對數(shù)生長期為第4至第7天，而MARC145細胞對數(shù)生長期為第4至第8天。由圖3所示，MTT法測得細胞生長曲線結(jié)果與圖2細胞平板計數(shù)法相似。

圖2 細胞計數(shù)法繪制MA104和MARC145細胞生長曲線圖

圖3 MTT法繪制MA104和MARC145細胞生長曲線圖

2.3 梯度濃度魚腥草多糖對MA104和MARC145細胞活力的影響 由圖4可知，50 mg/mL的HCP對MA104細胞活力有抑制作用，且OD值顯著低于對照組(P<0.05)；HCP濃度為0.05、0.5、5 mg/mL組細胞OD值顯著高于對照組(P<0.05)， 0.005 mg/mL HCP細胞OD值與對照組無顯著顯著(P>0.05)。

由圖5可知，50 mg/mL的HCP對MARC145細胞活性有抑制作用，且OD值極顯著低于對照組(P<0.01)；HCP濃度為0.05、0.5、5 mg/mL的三組細胞OD值與對照組比較顯著提高(P<0.05)；HCP濃度為0.005 mg/mL的細胞組，OD值與對照組差異不顯著。

圖4 魚腥草多糖對MA104細胞活力的影響

圖5 魚腥草多糖對MARC145細胞活力的影響

2.4 魚腥草多糖對MA104和MARC145細胞形態(tài)的影響 由圖6可知，0 mg/mL的HCP(正常對照)處理24 h后，MA104和MARC145細胞形態(tài)正常，呈明顯的鋪路石樣；0.5 mg/mL的HCP處理24 h后，MA104和MARC145細胞形態(tài)正常，比正常對照細胞間隙更緊密，折光率也更高；50 mg/mL的HCP處理24 h后，MA104和MARC145細胞形態(tài)出現(xiàn)變圓皺縮，個別細胞脫壁；500 mg/mL的HCP處理24 h后，MA104和MARC145細胞破裂聚集，產(chǎn)生大量細胞碎片，只見個別細胞貼壁，形態(tài)呈煎蛋樣壞死。

圖6 魚腥草多糖對MA104和MARC145細胞形態(tài)的影響(200×)

3 討論與結(jié)論

MTT法可直接檢測活細胞中線粒體酶活性，MTT結(jié)晶形成的量和細胞數(shù)成正比，從而反映細胞數(shù)量和活力，因此，MTT法檢測細胞活力更直接。本試驗同時運用細胞平板計數(shù)法和MTT法檢測細胞活力，結(jié)果顯示兩種方法繪制的細胞生長曲線基本相似，MTT法更方便直觀，且在臨床應用廣泛[12]。因此，下一步藥效學試驗選取MTT法檢測細胞活力。

本研究表明，高濃度HCP(50 mg/mL)對MA104和MARC145細胞活力有明顯抑制作用，本試驗觀察到細胞形態(tài)明顯收縮，可能與多糖改變細胞滲透壓有關；0～0.005 mg/mL的HCP對MA104和MARC145細胞活力無顯著影響；0.05～5 mg/mL的HCP對MA104和MARC145細胞活力有明顯促進作用。前人研究表明，魚腥草粗提物對MARC145細胞最大安全作用質(zhì)量濃度為1.563 mg/mL[13]，本研究表明小于等于5 mg/mL的HCP對MARC145細胞安全，說明同濃度的HCP比粗提物對MARC145細胞更安全，毒副作用更低。不同制備方法配制成20 mg/mL的HCP對三種病毒均有抑制作用，且對RD細胞和Hep2細胞無毒副作用[6]，說明HCP對多種細胞具有較高的安全性，適用范圍更廣。300 μg/mL HCP對人結(jié)腸癌細胞LoVo、人肝癌細胞HepG2和小鼠白血病細胞L1201的生長均有顯著的抑制作用[14]，提示其對細胞的影響具有雙向調(diào)節(jié)作用。因此，本研究表明，梯度濃度的HCP對MA104和MARC145細胞活力的影響，可篩選促生長最佳濃度劑量范圍和毒性劑量，為進一步開展后續(xù)研究奠定基礎。

HCP(0～5 mg/mL)對MA104和MARC145細胞無毒性作用，為深入研究HCP的藥理機制提供了試驗依據(jù)。