韓美珍，徐中清，才學(xué)鵬，李秀輝

(1. 北京中海生物科技有限公司，北京100081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；3.中國獸藥協(xié)會，北京100081；4.中海生物技術(shù)(棗莊)有限公司)，山東棗莊277000)[收稿日期] 2021-10-09 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1002-1280 (2022) 03-0046-07 [中圖分類號]S859.797

豬丹毒(Swine Erysipelas，SE)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrixrhusiopathiae，ER)引起的一種急性熱傳染病，也是一種人畜共患病，呈世界性分布。豬多殺性巴氏桿菌病(Swine Pasteurellosis)是由豬多殺性巴氏桿菌(SwinePasteurellamultocida)引起的一種傳染病[1]，又名豬肺疫、豬出血性敗血癥，俗稱 “鎖喉風(fēng)”。該病廣泛分布于世界各地，是豬的一種常見傳染病。豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，被我國列為一類動物疫病，是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。目前，生產(chǎn)上常用豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗對豬瘟豬丹毒豬肺疫三種疾病進(jìn)行免疫防控，其免疫效果直接影響著養(yǎng)豬行業(yè)的發(fā)展和廣大養(yǎng)殖戶的利益，而影響免疫效果的決定性因素是疫苗中有效抗原的含量。

活菌計數(shù)是疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要參數(shù)，對于評價疫苗的安全性和免疫效力有重要意義。多年來，一直使用干粉馬丁瓊脂或者新鮮馬丁瓊脂作為計數(shù)瓊脂，由于豬肺疫和豬丹毒在馬丁瓊脂上的菌落形態(tài)相近，有時甚至?xí)袃煞N菌落重疊或覆蓋的情況，肉眼不易區(qū)分，所以無法準(zhǔn)確計算每頭份三聯(lián)苗中分別含有的活菌數(shù)。鑒于此，我們研制出了一種檢測豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗中豬丹毒和豬肺疫抗原含量的選擇性顯色培養(yǎng)基作為活菌計數(shù)瓊脂。

1 材料與方法

1.1 實驗用菌種 豬多殺性巴氏桿菌CVCC1765株菌種，即EO630株，弱毒株；豬丹毒桿菌CVCC1319株菌種，即G4T10株，弱毒株；二者均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。按照《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》二〇〇〇年版中的方法制備豬肺疫菌液和豬丹毒菌液。

1.2培養(yǎng)基及耗材 干粉馬丁瓊脂產(chǎn)自北京中海生物科技有限公司，按照產(chǎn)品要求配制而成，為本研究的對照組一；新鮮馬丁瓊脂由北京中海生物科技有限公司供應(yīng)，為本研究中物理性狀對比部分的對照組二；豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基按照以下原材料配方配制：蛋白胨40 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15 g、顯色劑0.02 g、純化水1000 mL，為本研究的實驗組。豬多殺性巴氏桿菌單價活疫苗(EO630株)、豬丹毒單價活疫苗(G4T10株)和豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗各10瓶，均購買自九江博美萊生物科技有限公司。無菌玻璃吸管和器皿由北京中海生物科技有限公司供應(yīng)；一次性平皿(直徑9 cm)，購買自青島金典生化器材公司。

1.3 理化特性對比 干粉馬丁瓊脂、新鮮馬丁瓊脂和豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基均按照規(guī)程添加4%健康動物血清和0.1%裂解血球全血[2]，制備瓊脂平板，比較三種培養(yǎng)基理化參數(shù)差異。由于商品化干粉培養(yǎng)基應(yīng)用越來越廣泛，制備過程簡單，批間差異小，在干粉馬丁瓊脂平板上培養(yǎng)細(xì)菌，其菌落數(shù)和菌落形態(tài)與新鮮馬丁瓊脂差異不大[3]，因此以下研究僅用干粉馬丁瓊脂作為對照組。

1.4 菌落生長實驗 干粉馬丁瓊脂和豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基均按照1.3項方法制備瓊脂平板。分別接種豬肺疫菌液和豬丹毒菌液進(jìn)行活菌計數(shù)[4]。比較三種計數(shù)平板上的菌落形態(tài)和活菌數(shù)差異，并計算豬三聯(lián)顯色瓊脂上兩種菌的菌落回收率(回收率=實驗組計數(shù)/對照組計數(shù))。

將豬肺疫菌液和豬丹毒菌液按照1∶1比例混合均勻，按照規(guī)程方法稀釋至適宜濃度[5]，接種干粉馬丁瓊脂平板和豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基平板，觀察平板上兩種菌落形態(tài)，并計算菌落數(shù)量和菌落回收率。

1.5 顯色底物添加量對比實驗 配制豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基：先配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基(蛋白胨40 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15 g、純化水1000 mL)，再加入顯色底物，添加量分別為0.01 g、0.02 g、0.04 g、0.08 g，依次命名為配方一、配方二、配方三、配方四。將四種豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基配方的瓊脂平板和干粉馬丁瓊脂平板分別接種豬肺疫菌液和豬丹毒菌液進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.6 重復(fù)性和準(zhǔn)確性實驗 從購買的10瓶豬肺疫EO630株單價活疫苗和10瓶豬丹毒G4T10株單價活疫苗中，分別隨機(jī)抽取5瓶，分別用無菌蛋白胨水稀釋成1 mL/頭份，再稀釋至適宜濃度后，分別接種豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基瓊脂平板和干粉馬丁瓊脂平板，并對菌落進(jìn)行計數(shù)，即為兩種單價苗的實際抗原含量。

1.7 對豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗成品的檢測從購買的10瓶豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗中，隨機(jī)抽取5瓶，用無菌蛋白胨水稀釋成1 mL/頭份，再稀釋至適宜濃度后，接種豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基瓊脂平板和干粉馬丁瓊脂平板。對干粉馬丁瓊脂中的大菌落和小菌落分別計數(shù)，并對豬三聯(lián)顯色瓊脂平板中的紅色菌落和灰白色菌落分別計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 物理性狀對比 三種計數(shù)瓊脂相比(見表1)，干粉馬丁瓊脂的顏色較深，相對另外兩種瓊脂，不利于菌落觀察和計數(shù)。新鮮馬丁瓊脂制備工藝繁瑣，而且原材料來源不穩(wěn)定，很容易影響培養(yǎng)基質(zhì)量。而豬三聯(lián)顯色瓊脂原材料配方簡單，配制方法容易，而且瓊脂顏色較淺，有利于菌落觀察和計數(shù)。所以，本研究中的豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基在使用過程中更有優(yōu)勢。

表1 計數(shù)瓊脂理化特性對比

2.2 菌落生長實驗 通過肉眼觀察，豬肺疫和豬丹毒在馬丁瓊脂上僅能以大小來區(qū)分，而在顯色培養(yǎng)基上，豬肺疫為大菌落，且菌落呈紅色，豬丹毒為小菌落，且菌落呈灰白色，略帶黃色[6]，在計數(shù)過程中更直觀(圖1)。由計數(shù)結(jié)果得出，本研究中的豬三聯(lián)顯色瓊脂平板與對照馬丁瓊脂平板上的兩種抗原含量無明顯差異，而且兩種抗原菌的菌落回收率均能達(dá)到1.00以上?；旌蠘悠返挠嫈?shù)結(jié)果均能達(dá)到單一菌液計數(shù)結(jié)果的一半，與預(yù)期結(jié)果一致(表2)。

表2 菌落生長實驗對比結(jié)果

圖1 豬丹毒G4T10和豬肺疫EO630混合液接種兩種培養(yǎng)基的菌落形態(tài)比較(彩圖見封三)

2.3 顯色劑添加量對比實驗 結(jié)合表3、表4結(jié)果得出，顯色底物加量對豬丹毒菌落生長形態(tài)和活菌數(shù)沒有影響，對豬肺疫的計數(shù)結(jié)果影響明顯：當(dāng)顯色底物加量大于0.02 g/L時，對豬肺疫菌落生長有抑制作用，而且顯色底物加量越多，抑制作用越明顯；而顯色底物加量小于0.02 g/L時，豬肺疫菌落顏色較淺。綜合以上結(jié)果，確定此豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗抗原菌選擇性顯色培養(yǎng)基的顯色劑加量為0.02 g/L。

表3 顯色底物添加量對抗原含量的影響

表4 顯色底物添加量對菌落形態(tài)的影響

2.4 重復(fù)性和準(zhǔn)確性實驗 將表5、表6中EO630單價苗和G4T10單價苗的計數(shù)結(jié)果經(jīng)方差分析得出(表7)，隨機(jī)抽取的5個豬肺疫單價苗和5個豬丹毒單價苗的抗原菌含量在顯色培養(yǎng)基和馬丁瓊脂上均無明顯差異(P>0.05)。而且菌落回收率曲線趨勢平穩(wěn)，均能維持在1.0±0.1。結(jié)果表明豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基的重復(fù)性和準(zhǔn)確性都很好。

表5 EO630單價苗用兩種瓊脂計數(shù)結(jié)果

表6 G4T10單價苗用兩種瓊脂計數(shù)結(jié)果

表7 單價苗在兩種瓊脂上計數(shù)結(jié)果的方差分析

2.5 對豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗成品的檢測結(jié)果 將表8的豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗計數(shù)結(jié)果經(jīng)方差分析(表9)得出，顯色培養(yǎng)基與馬丁瓊脂上的豬肺疫EO630和豬丹毒G4T10抗原含量的計數(shù)結(jié)果無明顯差異(P>0.05)。

表8 豬三聯(lián)活疫苗成品抗原含量計數(shù)結(jié)果

表9 豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗在兩種瓊脂上計數(shù)結(jié)果的方差分析

3 小結(jié)與討論

3.1 研究結(jié)論 本研究通過平行對比豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基和馬丁瓊脂得出，豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基在瓊脂顏色方面優(yōu)于對照組一干粉馬丁瓊脂，在制作方法和保質(zhì)期方面優(yōu)于對照組二新鮮馬丁瓊脂。在菌落生長方面，豬肺疫能在顯色培養(yǎng)基上顯紅色，而豬丹毒為灰白色，能通過肉眼快速、準(zhǔn)確地鑒別。同時，該顯色培養(yǎng)基的活菌計數(shù)結(jié)果與干粉馬丁瓊脂沒有顯著性差異(P>0.05)，菌落回收率能達(dá)到0.9以上。顯色底物的加量對比實驗表明，顯色底物的加量會影響豬肺疫活菌計數(shù)的結(jié)果，當(dāng)加量為0.02 g/L時，顯色效果最好，且對菌落生長沒有抑制。因此，確定該豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基的主要成分為：蛋白胨40 g、氯化鈉5 g、瓊脂粉15 g、顯色底物0.02 g、純化水1000 mL，調(diào)節(jié)pH7.2～7.6。

3.2 研究過程遇到的問題 在豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)苗成品檢測過程中發(fā)現(xiàn)，成品疫苗會在凍干及保存等過程中，部分抗原菌變?nèi)趸蛩ネ?，部分菌落有生長延遲的現(xiàn)象，導(dǎo)致接種在計數(shù)平板上菌落大小不均一。尤其是豬肺疫，培養(yǎng)24 h時,部分豬肺疫菌落生長延遲，直徑大小和豬丹毒菌落差不多，肉眼不易區(qū)分，只能繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，待豬肺疫菌落長大，再進(jìn)行菌落計數(shù)。而在豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)24 h時，無論豬肺疫菌落大小，都能顯紅色，從而可以快速準(zhǔn)確區(qū)分豬肺疫菌落和豬丹毒菌落。

3.3 應(yīng)用推廣 目前，利用顯色底物、熒光底物與酶的特異性反應(yīng)來檢測、鑒定含特異性酶的微生物的新技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來，其中利用酶顯色底物的顯色培養(yǎng)基檢測不需要任何輔助設(shè)備，敏感性強(qiáng)、特異性高[7]，得到廣泛的應(yīng)用。本研究中的豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基就是通過添加酶顯色底物，與豬肺疫中含有的特異性酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生紅色物質(zhì)，從而通過直接觀察菌落顏色即可對菌種做出鑒定，克服了之前在馬丁瓊脂上，豬肺疫和豬丹毒兩種菌落形態(tài)、顏色相近的缺點，從而能快速、準(zhǔn)確地計算兩種菌的抗原含量。

在豬丹毒豬肺疫二聯(lián)苗、豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗的檢驗過程中，可能會受到多種因素影響[8]，如培養(yǎng)基質(zhì)量、血清質(zhì)量、培養(yǎng)條件、平板的平整度等，經(jīng)常出現(xiàn)接種在馬丁瓊脂上的豬肺疫菌落大小不均一、或者兩種菌落重疊和覆蓋的情況，導(dǎo)致豬肺疫和豬丹毒不能肉眼區(qū)分，從而不能準(zhǔn)確地計算出疫苗抗原含量，重復(fù)檢驗或者輔助其他鑒別方法均會大大降低工作效率。因此利用顯色培養(yǎng)基就能快速準(zhǔn)確地進(jìn)行鑒別和計數(shù)，大大提高了檢測效率。

活菌計數(shù)是疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要參數(shù)，對于評價疫苗的安全性和免疫效力有重要意義。在細(xì)菌類疫苗生產(chǎn)過程中，無論是單價苗、二聯(lián)苗還是三聯(lián)苗，半成品檢驗、配苗以及成品檢驗等步驟均需要活菌計數(shù)來監(jiān)測抗原菌含量，因此計數(shù)瓊脂的高靈敏性和準(zhǔn)確性就體現(xiàn)了很重要的作用。經(jīng)研究表明，豬三聯(lián)顯色培養(yǎng)基的計數(shù)結(jié)果與對照組馬丁瓊脂無明顯差異，因此可以代替馬丁瓊脂用于此類疫苗生產(chǎn)過程中的活菌計數(shù)和純粹檢驗。