◎ 胡江如，蔣 艷，韓素素，胡 爽，徐帥磊，粟金嶺，陳正培

（1.柳州工學(xué)院 招標(biāo)采購中心，廣西 柳州 545616；2.柳州工學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545616；3.柳州工學(xué)院 機(jī)械工程學(xué)院，廣西 柳州 545616）

螺螄粉是廣西壯族自治區(qū)柳州市的特色小吃之一，具有辣、爽、鮮、酸和燙的獨(dú)特風(fēng)味。湯料是螺螄粉的核心，對(duì)螺螄粉的風(fēng)味及營養(yǎng)有重要的影響，其中的田螺是螺螄粉湯料風(fēng)味獨(dú)特的必備原料，當(dāng)其在湯料中比例過小時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響螺螄湯的色澤及風(fēng)味，讓其平淡無奇，沒有特色[1]。PCR技術(shù)在食品檢驗(yàn)中具有十分明顯的優(yōu)越性，通過高溫變性、低溫退火及中溫延伸3步循環(huán)操作實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增，從而對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行鑒定[2-4]。本研究基于PCR技術(shù)建立一種田螺的基因檢測(cè)方法，在推動(dòng)螺螄粉標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、提高監(jiān)督效率、降低監(jiān)督成本和維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益方面具有重要意義[5-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

石螺、田螺、花甲和車螺，均購于廣西柳州雒容綜合市場(chǎng)。

1.1.2 試劑與藥品

乙二胺四乙酸（分析純），廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；硼酸（分析純），廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；三（羥甲基）氨基甲烷TRIS，北京索萊科技有限公司；瓊脂糖，北京萊博潤科生物科技有限公司；PCR酶制劑，北京博邁德生物科技有限公司；DL 107-01組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒（50次），北京博邁德生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

T100 PCR擴(kuò) 增 儀，BIO-RAD；GenoSens 1880凝膠成像分析系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Eppendorf 5425型離心機(jī)，德國艾本德股份公司；移液槍，德國艾本德股份公司。

1.2 PCR引物的選擇

利用田螺DNA序列設(shè)計(jì)5對(duì)引物，具體如表1。

表1 特征性引物表

1.3 基因組DNA的提取與引物的組合

每種動(dòng)物活體解剖去殼后，取前端軟體組織，利用液氮將其磨碎成粉，參照試劑盒說明書提取DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。提取出DNA后，利用單細(xì)胞PCR技術(shù)得到擴(kuò)增結(jié)果較好的引物組別，并將其排列組合后進(jìn)行多重PCR的擴(kuò)增。得到最佳組合后對(duì)其進(jìn)行田螺的特異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

運(yùn)用柱層析法提取DNA，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出車螺、石螺、田螺和花甲。由圖1可知，4種樣品的DNA均被提取出來，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 4種基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖

2.2 田螺DNA的單引物擴(kuò)增結(jié)果

用5對(duì)引物分別對(duì)田螺基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，PCR產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖2可知引物3、引物4、引物5的F及R進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，田螺出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，且擴(kuò)增效率較好，退火溫度以60 ℃最佳；利用引物2擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增效率較差；利用引物1進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)沒有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 田螺基因組DNA的5組引物擴(kuò)增結(jié)果圖

2.3 田螺DNA的雙重引物擴(kuò)增結(jié)果

將擴(kuò)增效率較好的引物3、引物4和引物5進(jìn)行組合，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。由圖3可知，組合②④即F4+R4、F4+R5，F(xiàn)3+R4、F3+R5的擴(kuò)增效果較好。

圖3 雙重引物對(duì)田螺DNA的擴(kuò)增結(jié)果圖

2.4 驗(yàn)證雙重引物對(duì)田螺DNA擴(kuò)增的特異性

用優(yōu)化的雙重引物F4+R4/F4+R5分別對(duì)石螺、田螺、花甲和車螺4種樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖4可知，田螺出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，其他樣品沒有出現(xiàn)，說明優(yōu)化的雙重引物只對(duì)田螺的DNA片段具有較好的特異性。

圖4 雙重引物對(duì)4種軟體動(dòng)物DNA的擴(kuò)增結(jié)果圖

3 結(jié)論與討論

PCR技術(shù)作為一種體外酶促合成、擴(kuò)增特定DNA片段的方法，因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快和準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)、微生物檢測(cè)、臨床微生物和食品中各種動(dòng)物源性成分的檢測(cè)等，而多重PCR是可以同時(shí)針對(duì)幾個(gè)目標(biāo)片段進(jìn)行檢測(cè)的PCR技術(shù)。國內(nèi)外研究者利用多重PCR技術(shù)進(jìn)行了很多研究，但研究多集中在螺螄以外的畜肉及禽肉，螺螄和畜肉的組合研究及螺螄和禽肉的組合研究很少有報(bào)道[8-11]。本文通過運(yùn)用多重PCR技術(shù)建立了一種高效的田螺目的基因檢測(cè)方法，為螺螄粉湯料真?zhèn)舞b定提供了技術(shù)支持。