◎ 王歲歲

（馬鞍山市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，安徽 馬鞍山 243000）

脫氫乙酸（Dehydroacetic Acid，DA），別名二乙酰基乙酰乙酸，性狀為無色至白色針狀或板狀結(jié)晶或白色結(jié)晶粉末，無臭，略帶酸味，不易溶于水，易溶于堿性溶液。脫氫乙酸飽和水溶液pH=4。脫氫乙酸具有很好的防腐、防霉效果[1-3]，其中對(duì)霉菌和酵母的抑菌能力最強(qiáng)[4]。脫氫乙酸常作為防腐劑被用于腐乳、 醬菜、糕點(diǎn)等食品中。食入的脫氫乙酸達(dá)到一定的劑量后，對(duì)人體具有潛在危害[5]。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的脫氫乙酸含量對(duì)把控脫氫乙酸的攝入量具有重要意義。

目前國標(biāo)中檢測(cè)食品中脫氫乙酸的方法主要有氣相色譜法[6-7]和液相色譜法[8-11]。其中，液相色譜法前處理煩瑣而低效，重現(xiàn)性不好，且易出現(xiàn)峰拖尾、分叉等現(xiàn)象，不利于脫氫乙酸的定性及定量。脫氫乙酸電離常數(shù)較低，不同的酸堿條件可能影響脫氫乙酸的出峰效果[12]。因此，本研究以綠豆糕為樣品，基于高效液相色譜法，建立簡單易操作的脫氫乙酸檢測(cè)方法，并考察流動(dòng)相的pH值升高對(duì)脫氫乙酸峰形的改善作用，為今后快速有效檢測(cè)食品中的脫氫乙酸提供重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：綠豆糕，市場(chǎng)購買。

脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：TMstandard，批號(hào)21060503；沉淀劑1：亞鐵氰化鉀溶液，稱取106 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容到1 000 mL；沉淀劑2：乙酸鋅溶液，稱取220 g乙酸鋅用少量水溶解，加入30 mL冰乙酸，用水定容到1 000 mL；氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）：稱取20 g氫氧化鈉溶于水中，并定容到1 000 mL；甲醇：色譜純；乙酸銨溶液（0.02 mol·L-1）：稱取1.54 g乙酸銨，用水溶解并定容至1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-20AT高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器）：日本島津科學(xué)儀器公司；AL204電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；CQ-300B-S超聲波清洗機(jī)：上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠；ST5000/F pH計(jì)：奧豪斯儀器（常州）有限公司；HC-3018R冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；針式濾膜：水相濾膜，0.22 μm；Angilent HC-C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)基本條件

本實(shí)驗(yàn)選用Angilent HC-C18色譜柱（pH耐受范圍為2～9）；流動(dòng)相為甲醇∶乙酸銨（0.02 mol·L-1）=7 ∶ 93；流速為 1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為 10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取0.250 0 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品。用5 mL氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）溶解后，用水定容至25 mL，即為1 000 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水 逐 步 稀 釋 至 1 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1和 100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。

1.3.3 樣品前處理

稱取綠豆糕約2 g置于50 mL離心管中，加水30 mL，混勻后分別加入3 mL沉淀劑1和3 mL沉淀劑2，混勻，用20 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)樣液酸堿值，用pH試紙測(cè)試，調(diào)至pH=7～8；超聲提取20 min后，4 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容，取適量過0.22 μm的濾膜，待上機(jī)。

1.3.4 流動(dòng)相pH值的調(diào)節(jié)

用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)乙酸銨溶液的pH值，用pH計(jì)測(cè)定。分別調(diào)節(jié)至pH=7.5、pH=8.0、pH=8.5和pH=9.0共4個(gè)梯度。

1.3.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

以綠豆糕為本底，添加3個(gè)不同濃度的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測(cè)其脫氫乙酸值，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的選擇

利用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫氫乙酸的最大吸收波長為293 nm。

2.2 流動(dòng)相pH值對(duì)脫氫乙酸峰形的影響

由圖1可知，未調(diào)節(jié)乙酸銨溶液pH值前，脫氫乙酸峰拖尾、不對(duì)稱，影響脫氫乙酸的定性和定量。將乙酸銨溶液pH值調(diào)至7.5時(shí)，脫氫乙酸峰依舊拖尾嚴(yán)重，如圖2。繼續(xù)調(diào)高乙酸銨溶液pH值至8.0，如圖3所示，脫氫乙酸峰仍舊有拖尾現(xiàn)象，但相比于圖1和圖2，峰拖尾現(xiàn)象有所減緩。調(diào)節(jié)乙酸銨溶液pH值至8.5，脫氫乙酸出峰效果如圖4所示，此時(shí)脫氫乙酸峰形良好，峰尖銳且對(duì)稱，無拖尾現(xiàn)象。當(dāng)乙酸銨溶液pH值調(diào)至9.0時(shí)，結(jié)果如圖5所示，脫氫乙酸峰形良好，無拖尾現(xiàn)象，與圖4相比無顯著差別。由上說明，乙酸銨溶液的pH值高低對(duì)調(diào)節(jié)脫氫乙酸的峰形有一定的作用，在一定范圍內(nèi)，pH值越高，峰形越好，拖尾現(xiàn)象越不明顯。當(dāng)pH值達(dá)到8.5時(shí)，峰形達(dá)到最優(yōu)，繼續(xù)升高乙酸銨溶液pH值，峰形無顯著變化，結(jié)合色譜柱的酸堿耐受性（pH<9），因此選擇乙酸銨溶液pH=8.5為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

圖1 脫氫乙酸20 μg·mL-1色譜圖（未調(diào)節(jié)pH值）

圖2 脫氫乙酸20 μg·mL-1色譜圖（pH=7.5）

圖3 脫氫乙酸20 μg·mL-1色譜圖（pH=8.0）

圖4 脫氫乙酸10 μg·mL-1色譜圖（pH=8.5）

圖5 脫氫乙酸 20 μg·mL-1色譜圖（pH=9.0）

2.3 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)系列濃度在上述實(shí)驗(yàn)條件下上機(jī)進(jìn)樣，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。由圖6可知，在1～100 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，脫氫乙酸響應(yīng)值與濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=31 923x，其線性相關(guān)性系數(shù)R2=0.999 9。

圖6 脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 方法回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差確定

將處理好的綠豆糕樣品溶液在上述實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，根據(jù)脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，計(jì)算得綠豆糕中脫氫乙酸的含量為 0.260 g·kg-1。分別添加 0.10 g·kg-1、0.20 g·kg-1、0.30 g·kg-1濃度的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品于綠豆糕中，測(cè)定其回收率，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在本實(shí)驗(yàn)條件下綠豆糕的加標(biāo)回收率為95%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～1.7%。說明此方法結(jié)果值可信，具有一定的可操作性。

表1 綠豆糕加標(biāo)回收率測(cè)定表

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)探討了簡便且適用的檢測(cè)綠豆糕中脫氫乙酸的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫氫乙酸在293 nm處得到最大吸收峰。流動(dòng)相設(shè)為甲醇∶0.02 mol·L-1乙酸銨=7∶93，能很好地將脫氫乙酸與糖精鈉等干擾峰分離。增大乙酸銨溶液的pH值，脫氫乙酸的峰形逐漸被改善，拖尾現(xiàn)象得到緩解，說明乙酸銨溶液的酸堿度在一定范圍內(nèi)對(duì)調(diào)節(jié)脫氫乙酸的出峰效果起到了很大作用。將乙酸銨溶液pH值調(diào)至8.5，脫氫乙酸峰形尖銳且對(duì)稱，能達(dá)到最優(yōu)的出峰效果，解決了以前脫氫乙酸峰拖尾及出現(xiàn)鬼峰等現(xiàn)象。對(duì)綠豆糕進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，得到回收率為95%～100%，說明此方法具有一定可操作性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中基于高效液相色譜法檢測(cè)綠豆糕中脫氫乙酸的方法，具有簡單易操作、快速、出峰效果好、結(jié)果值可信以及重復(fù)性好等特點(diǎn)，適用于檢測(cè)食品中的脫氫乙酸含量。