◎ 楊靜思，劉玲怡，韓 琴，趙玉英，尹晟旭，劉太林

（天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700）

漆酶是多酚氧化酶中一種含多個(gè)銅離子的糖蛋白氧化酶，其來(lái)源廣泛，在高等植物、真菌、細(xì)菌和動(dòng)物等中都能發(fā)現(xiàn)[1]。漆酶是由日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，距今已有100多年，其中研究最廣泛的是真菌漆酶，不同來(lái)源的漆酶結(jié)構(gòu)功能上都有一定的差異[2-3]。漆酶是一種綠色生物催化劑，反應(yīng)產(chǎn)生水，能與抗壞血酸、胺、酚等物質(zhì)反應(yīng)，還能催化氧化多種難以降解的氯酚類污染物、染料、多環(huán)芳烴、生物色素、氯仿、苯系物及其衍生物以及山硝基甲苯等。其主要應(yīng)用于催化底物、食品加工、生物檢測(cè)、工業(yè)廢水和造紙廢水處理等方面；但是游離的漆酶對(duì)外界敏感、穩(wěn)定性差、易失活，不利于回收重復(fù)利用。對(duì)漆酶進(jìn)行固定化研究不僅能解決這些問(wèn)題，還能節(jié)約成本提高漆酶利用效率[4]。

固定化酶是指用某些載體和某些方法將游離的酶限制在一定的空間或吸附在某些載體上，使之不能隨意移動(dòng)，但仍具有活性結(jié)構(gòu)和功能[5]。酶的固定化顯著提高了酶的穩(wěn)定性、重復(fù)利用率、抗逆性，受外界影響較小，使得酶可以在反應(yīng)中重復(fù)利用。目前酶的固定化載體非常多，常用的有殼聚糖、尼龍網(wǎng)、二氧化硅、復(fù)合材料和活性炭等。固定化的方法有交聯(lián)法、吸附法、共價(jià)結(jié)合法、熱處理法和包埋法等[6]。酶固定化的核心要點(diǎn)是酶活性基本不降低，不影響酶的活性中心和結(jié)合位點(diǎn)，且其與載體結(jié)合牢固，不易脫落[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漆酶（上海寶曼生物科技有限公司）；尼龍網(wǎng)、2,2’-聯(lián)氮雙（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）、二銨鹽（ABTS，酷爾化學(xué)科技有限公司）；一次性注射器、海藻酸鈉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；檸檬酸（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；戊二醛、Na2HPO4、NaH2P04、HCL、CaCl2及甲醇溶液，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR124CN電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-1000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（天津市歐諾儀器有限公司）；WE-1水浴恒溫振蕩器（天津市歐諾儀器有限公司）；DT5-6B低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；SB-3200DTDN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；pH計(jì)（上海般特儀器制造有限公司）；BCD-254冰箱（博西華家用電器有限公司）；G90F23CN3LV-C2（S5）微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離酶活力的測(cè)定

稱取1 g漆酶溶于40 mL蒸餾水中，攪拌均勻后2 000 r·min-1離心10 min，分離出上清液即為游離酶溶液，用于測(cè)定初始的酶活力；再取1 mL酶液，加入4.6 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，0.4 mL ABTS，利用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定從起始到結(jié)束的吸光度值，然后根據(jù)公式（1）計(jì)算酶活力[8]。

1.3.2 固定化漆酶的制備

（1）包埋法固定漆酶。稱取一定量的海藻酸鈉，加入蒸餾水，置于微波爐中加熱使之溶解成均勻的海藻酸鈉膠體；取1 mL酶液加入到4 mL海藻酸鈉膠體中并攪拌均勻使其充分混合，然后用帶針頭的注射器將混合好的海藻酸鈉酶液逐滴滴入CaCl2溶液中，盡可能形成形狀大小相似的均勻球狀凝膠顆粒（2～3 mm），靜置20 min后，放于水浴搖床上振蕩固定。將振蕩完畢的固定化漆酶取出，用布氏漏斗濾去氯化鈣溶液，再用蒸餾水洗滌固定化漆酶凝膠顆粒，重復(fù)操作3次，以除去未固定化的氯化鈣，放于室溫下干燥，得到干燥固定化漆酶[9]。

（2）交聯(lián)法固定漆酶。對(duì)張書祥等[10]的試驗(yàn)方法加以改進(jìn)。取1 g尼龍網(wǎng)（1 cm×1 cm）洗凈、晾干，用18.6%CaCl2、18.6%水的甲醇溶液在室溫下保溫10 min，洗凈后吸干；于3.65 mol·L-1HCl中水解45 min，洗至pH中性，吸干；用不同濃度戊二醛進(jìn)行交聯(lián)后取出并洗去多余戊二醛，立即加入適量酶液并在4 ℃下固定，用緩沖液清洗后得到固定化漆酶。

1.3.3 固定化漆酶活力測(cè)定

取1.3.2制備的固定化漆酶，加入4.6 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，0.4 mL ABTS在420 nm處測(cè)定從起始到結(jié)束的吸光度值，根據(jù)公式（1）計(jì)算酶活力。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

利用試驗(yàn)中測(cè)定的吸光度值，計(jì)算固定化漆酶活力，計(jì)算公式如下[11]。

式中：A1為起始時(shí)的吸光度值；A2為結(jié)束時(shí)的吸光度值；t為吸光度值從A1增加到A2所經(jīng)歷的時(shí)間，s；ε為消光系數(shù) 3.6×104［(mol·L-1)·cm］-1。

1.3.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以漆酶活力回收率作為指標(biāo)，分別對(duì)以下因素水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

（1）包埋法固定漆酶。海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別取2%、3%、4%、5%和6% 5個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)。固定化溫度分別設(shè)置45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃ 5個(gè)不同溫度水平。CaCl2溶液濃度分別取 0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1和 0.6 mol·L-15 個(gè)不同濃度。

（2）交聯(lián)法固定漆酶。戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別取3%、4%、5%、6%、7%和8%。交聯(lián)時(shí)間分別設(shè)置為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h。固定時(shí)間分別設(shè)置為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 和 6 h。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別對(duì)不同因素選取3個(gè)酶活力回收率最高的因素水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以獲得最佳固定條件，見(jiàn)表1、表2。

表1 包埋法固定漆酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表2 交聯(lián)法固定漆酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋法固定漆酶單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 溫度對(duì)固定化漆酶的影響

不同溫度對(duì)固定化漆酶的影響見(jiàn)圖1。隨著溫度的增加，固定化漆酶的活力回收率也在增加，當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，固定化酶活力回收率達(dá)到了最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，固定化酶活力回收率開始下降。溫度過(guò)高反而會(huì)降低漆酶的活性，因此選擇55 ℃為最佳固定溫度。

圖1 溫度對(duì)固定化酶活力回收率的影響圖

2.1.2 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化漆酶的影響

不同海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化漆酶的影響見(jiàn)圖2。固定化漆酶的活力回收率隨海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)3%時(shí)，酶活力回收率最高，隨后大幅度降低。這是因?yàn)楹Ｔ逅徕c的濃度在適當(dāng)范圍內(nèi)有利于微球成形，當(dāng)海藻酸鈉濃度較大時(shí)，成球不規(guī)則，載體通透性會(huì)降低，導(dǎo)致酶活力回收率降低[12]。

圖2 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力回收率的影響圖

2.1.3 氯化鈣濃度對(duì)固定化漆酶的影響

氯化鈣濃度對(duì)固定化漆酶的影響見(jiàn)圖3。當(dāng)氯化鈣濃度為0.2～0.4 mol·L-1時(shí)，隨著濃度的增大，固定化漆酶的活力回收率也逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)到0.4 mol·L-1時(shí)，酶活力回收率達(dá)到了最大，當(dāng)濃度逐漸上升時(shí)，酶活力回收率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是由于CaCl2濃度過(guò)低時(shí)固定化凝膠比較松散，凝膠孔徑比較大，酶容易流失。而CaCl2濃度過(guò)高時(shí)，分布在凝膠表面的Ca2+會(huì)增多，并與酶發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致固定化酶活力降低[13]。

圖3 氯化鈣濃度對(duì)固定化酶活力回收率的影響圖

2.2 交聯(lián)法固定漆酶單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析

2.2.1 戊二醛濃度對(duì)固定化漆酶的影響

不同戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化漆酶的影響見(jiàn)圖4。隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，漆酶的活力回收率也隨之增加，在戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，酶活力回收率達(dá)到最高，而后下降。這主要是因?yàn)檫^(guò)量的戊二醛可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，降低酶活性，從而影響酶活力回收率；此外，當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)大時(shí)，戊二醛易發(fā)生自聯(lián)反應(yīng)，且聚集體過(guò)密阻礙了酶與底物的接觸[14]。

圖4 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力回收率的影響圖

2.2.2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化漆酶的影響

交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化漆酶的影響見(jiàn)圖5。固定化漆酶活力回收率隨著交聯(lián)時(shí)間的增加而增加，并在交聯(lián)時(shí)間為4 h時(shí)，酶活力回收率達(dá)到最大，而后大幅度下降。這可能是由于隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)越來(lái)越緊密，使得固定化酶的傳質(zhì)阻力加大，造成酶活力降低，且長(zhǎng)時(shí)間低溫下的交聯(lián)反應(yīng)也會(huì)影響酶的活性[15]。

圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響圖

2.2.3 固定時(shí)間對(duì)固定化漆酶的影響

固定時(shí)間對(duì)固定化漆酶的影響見(jiàn)圖6。隨著固定時(shí)間的增加，酶活力回收率增加，在4 h時(shí)酶活力回收率最大，固定效果最好。之后再延長(zhǎng)固定時(shí)間，酶活力回收率不僅無(wú)明顯提高，反而下降。這是因?yàn)楣潭〞r(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)過(guò)于緊密，底物不易擴(kuò)散，從而影響酶促反應(yīng)速率，因此選擇固定時(shí)間為4 h。

圖6 固定時(shí)間對(duì)固定化酶活力回收率的影響圖

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 包埋法固定漆酶正交試驗(yàn)結(jié)果

以固定化漆酶活力回收率為參考指標(biāo)，由表3可知，各因素對(duì)酶活力回收率的影響大小依次為溫度＞海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞氯化鈣濃度。從k值分析來(lái)看，在溫度55 ℃、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、氯化鈣濃度為0.4 mol·L-1為固定漆酶的最佳工藝條件。由表4方差分析來(lái)看，溫度對(duì)酶的活力回收率影響顯著，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和氯化鈣濃度影響不顯著。將正交試驗(yàn)得到的最佳組合條件：溫度55 ℃、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、氯化鈣濃度0.4 mol·L-1進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在該條件下固定化漆酶的活力回收率分別為88%、89%、88%，均優(yōu)于其他方案結(jié)果，且RSD值為0.80%＜5.00%，因此此最佳試驗(yàn)條件得到驗(yàn)證。

表3 包埋法固定漆酶正交試驗(yàn)方案和結(jié)果表

表4 包埋法方差分析表

2.3.2 交聯(lián)法固定漆酶正交試驗(yàn)

以固定化漆酶活力回收率為參考指標(biāo)，由表5正交試驗(yàn)R值分析可知，3個(gè)因素對(duì)固定化漆酶的影響顯著性依次為固定時(shí)間＞交聯(lián)時(shí)間＞戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)，說(shuō)明固定時(shí)間對(duì)固定化漆酶的活力回收率的影響最為顯著。綜合考慮各因素，確定固定化漆酶的最佳交聯(lián)條件為5%戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、4 h交聯(lián)時(shí)間、4.5 h固定時(shí)間。由于得到的最佳固定化條件沒(méi)有在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9組試驗(yàn)方案中，因此需要對(duì)該理論最佳條件做驗(yàn)證試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證該方案的可靠性。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在該條件下固定化漆酶的活力回收率分別為82.2%、82.5%、81.8%，高于正交試驗(yàn)中最高酶活力回收率，且RSD值為0.43%＜5.00%，由此可知，該方案具有一定的可靠性。

表5 交聯(lián)法固定漆酶正交試驗(yàn)方案和結(jié)果表

表6方差分析結(jié)果顯示，固定時(shí)間對(duì)酶活力回收率最為關(guān)鍵，其他因素在此試驗(yàn)范圍內(nèi)沒(méi)有顯著差異，對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較小，與直觀分析結(jié)果一致。

表6 交聯(lián)法方差分析表

3 結(jié)論

（1）通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果可以確定溫度、包埋劑濃度（本試驗(yàn)為海藻酸鈉）、氯化鈣溶液濃度、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、交聯(lián)時(shí)間和固定時(shí)間均對(duì)固定化漆酶的活力有不同的影響。

（2）正交試驗(yàn)優(yōu)化海藻酸鈉包埋漆酶的最佳工藝條件為溫度55 ℃、海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、氯化鈣濃度為0.4 mol·L-1，最優(yōu)條件下的漆酶活力回收率的平均值為88.3%。

（3）正交試驗(yàn)優(yōu)化戊二醛交聯(lián)漆酶的最佳工藝條件為戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、交聯(lián)時(shí)間4 h、固定時(shí)間4.5 h，且最優(yōu)條件下的漆酶活力回收率的平均值為82.2%。

（4）本研究采用兩種方法對(duì)漆酶固定化工藝進(jìn)行優(yōu)化，所采用儀器簡(jiǎn)單、操作方便，可以為漆酶的固定化工藝研究提供一定的參考依據(jù)。