楊 云 劉小龍 饒靜秋 賀艷紅 韓克國 王 劍 袁智勇*

(1.西南林業(yè)大學(xué)，云南省高校極小種群野生動物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明，650224；2.文山市國家級自然保護(hù)區(qū)管護(hù)分局，文山，663099；3.紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，蒙自，661199)

越南趾溝蛙(Ranajohnsi)隸屬于兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)蛙屬[1]，是Smith[2]發(fā)表的新種，模式產(chǎn)地為越南林同省郎邊高原(Langbian Plateau，Lam Dong，Vietnam)。目前該蛙在國內(nèi)分布于廣西、廣東、海南和重慶，國外分布于越南和老撾[3-5]。2019年7月，在云南省文山壯族苗族自治州馬關(guān)縣古林箐省級自然保護(hù)區(qū)對兩棲爬行動物調(diào)查期間，于保護(hù)區(qū)核心區(qū)(22°45′16.36″ N，103°57′43.17″ E；海拔1 160 m)內(nèi)發(fā)現(xiàn)蛙屬物種6只，采集到蛙屬物種標(biāo)本1號(標(biāo)本號：SWFU 005647)，標(biāo)本現(xiàn)保存于西南林業(yè)大學(xué)。對采集的蛙屬物種標(biāo)本進(jìn)行了外部形態(tài)特征比較和分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定該物種為越南趾溝蛙，為云南兩棲動物分布新紀(jì)錄。本研究進(jìn)行了采集地生境描述、形態(tài)描述和分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析，為進(jìn)一步探討越南趾溝蛙的分布情況提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

將采集到的蛙屬物種雄性標(biāo)本(標(biāo)本號：SWFU 005647)的肝臟樣品儲存在體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中，用于后續(xù)的分子試驗(yàn)。整體標(biāo)本固定保存在體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇中。

1.2 形態(tài)學(xué)測量

依據(jù)費(fèi)梁等[4]的測量方法，用數(shù)顯卡尺對標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量，精確到0.1 mm。測量指標(biāo)：頭體長(snout-vent length，SVL)，自吻端至體后端的長度；頭長(head length，HL)，自吻端至上、下頜關(guān)節(jié)后緣的長度；頭寬(head width，HW)，最大頭部寬度；吻長(snout length，SL)，自吻端至眼前角的長度；鼻間距(internasal space，INS)，左右鼻孔內(nèi)緣之間的距離；眼間距(interorbital space，IOS)，左、右上眼瞼內(nèi)側(cè)緣之間的最窄距離；眼徑(diameter of eye，ED)，與體軸平行的眼球外露部分的直徑；上眼瞼寬(width of upper eyelid，UEW)，上眼瞼最大寬度；鼓膜徑(diameter of tympanum，TD)，鼓膜的水平直徑，測量到鼓膜邊緣的外緣；鼓膜到眼距離(tympanum-eye distance，TEY)，自眼孔的后緣至鼓膜的前緣；前臂及手長(length of lower arm and hand，LAHL)，自肘關(guān)節(jié)至Ⅲ指指尖；股骨長度(femur length，F(xiàn)EM)；脛骨長(tibia length，TIB)；跗足長(length of the foot and tarsus，LFT)，從脛跗關(guān)節(jié)到Ⅳ趾趾尖；足長(foot length，F(xiàn)L)，從跖骨內(nèi)結(jié)節(jié)基部至Ⅳ趾趾尖；第Ⅲ指指吸盤的水平直徑(the horizontal diameter of the finger Ⅲ digital disc，F(xiàn)3DSC)。

1.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

采用ThermoFisher Scientific公司DNA提取試劑盒提取標(biāo)本的DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用引?6S AR(5′-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3′)和16S BR(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′)[6]，對16S rRNA基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后送至北京擎科生物科技有限公司測序。使用Lasergene 7.0軟件包中的SeqMan對所得序列進(jìn)行質(zhì)量檢測和人工校對，生成一致序列。

根據(jù)Yuan等[7]對整個蛙屬的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果，選擇黃腿蛙(Ranamuscosa)作為外群，從GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載越南趾溝蛙(KX269182)、明全蛙(R.zhengi，KX269206)、中亞林蛙(R.asiatica，KX269200)、黑龍江林蛙(R.amu-rensis，KX269203)和黃腿蛙(AY779195)序列?；谧畲笏迫环?ML)和貝葉斯法(BI)重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用MEGA 7.0[8]和Clustal W 2.0[9]對所有序列進(jìn)行比對，用jModelTest 0.1.1計(jì)算最佳替換模型，使用RaxML 8.2.4版本運(yùn)行最大似然估計(jì)[10]。在ML分析下使用非參數(shù)自助重取樣重復(fù)1 000次來評估自引支持度。使用Mrbayes 3.1.2進(jìn)行貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析[11]，通過讓4條遞增加熱的馬爾科夫鏈運(yùn)行3 000萬代，每1 000代抽樣1次，得出后驗(yàn)概率分布。基于收斂情況，舍棄前25%的樹。使用Tracer v1.5檢測各運(yùn)行參數(shù)值是否收斂[12](有效樣本量大于200和潛在的尺度縮減因子值接近1來保證收斂)。最后使用MEGA 7.0[8]中的p-distance雙參數(shù)模型計(jì)算蛙屬物種間的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 生境描述

古林箐省級自然保護(hù)區(qū)屬于南亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候[13-14]，本次在云南省馬關(guān)縣采集的1號越南趾溝蛙標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)于海拔1 160 m左右的山間溪流內(nèi)，溪流水流緩慢，溪中有一些石塊。附近植被豐富，主要以灌木、草本植物和喀斯特地貌常綠闊葉林為主，間有小面積的低海拔熱帶雨林成分(圖1)。同域生境下發(fā)現(xiàn)的兩棲動物還有腹斑掌突蟾(Paramegophrysventripunctatus)、白斑棱皮樹蛙(Thelodermaalbopunctatum)、版納大頭蛙(Limnonectesbannaensis)和沙巴琴蛙(Nidiranachapaensis)。

2.2 形態(tài)描述

采集的越南趾溝蛙頭體長38.3 mm，其余各部位量度數(shù)據(jù)見表1。頭長大于頭寬；吻端鈍圓，突出于下唇；瞳孔橫橢圓形，眼間距略小于上眼瞼寬；鼓膜清晰；犁骨齒呈兩斜列。背面光滑，背側(cè)褶細(xì)，到鼓膜上方略彎曲；體背后部有小疣粒；體腹面光滑(圖2)。

表1 越南趾溝蛙標(biāo)本形態(tài)量度

指端略膨大，無溝；后肢細(xì)長，脛跗關(guān)節(jié)前伸達(dá)吻鼻之間或略超過吻端，左、右跟部重疊；脛長超過體長之半，明顯長于股部長；跗褶部位有小疣，趾端呈小吸盤狀，腹側(cè)具溝，趾間全蹼，蹼緣缺刻深。背面褐色，兩眼間有一深褐色橫紋，肩上方有“人”形褐色斑；四肢背面有深褐色橫紋；體腹面淺黃色，胸、腹部有深色的云斑(圖2)。

圖2 越南趾溝蛙(云南省古林箐省級自然保護(hù)區(qū)，)Fig.2 Rana johnsi from Gulinqing Provincial Nature Reserve，Yunnan，China() 注：A.背側(cè)面；B.背面；C.腹面 Note：A，Dorsolateral view.B，Dorsal view.C，Ventral view

指長順序?yàn)棰?Ⅰ<Ⅳ<Ⅲ，指基部有指基下瘤，指間無蹼，關(guān)節(jié)下瘤突出；掌突3個，橢圓形，第Ⅱ指掌突略圓，較弱小。趾長順序?yàn)棰?Ⅱ<Ⅲ<Ⅴ<Ⅳ，趾間蹼發(fā)達(dá)，關(guān)節(jié)下瘤明顯；內(nèi)蹠突橢圓形，外蹠突圓而??；跗褶部位具小疣(圖3)。

圖3 越南趾溝蛙手部及足部形態(tài)(云南省古林箐省級自然保護(hù)區(qū)，)Fig.3 Hands and foots of Rana johnsi from Gulinqing Provincial Nature Reserve，Yunnan，China() 注：A.手背面；B.手腹面；C.足背面；D.足腹面 Note：A，Dorsal view of hand.B，Ventral view of hand.C，Dorsal view of foot.D，Ventral view of foot

2.3 分子數(shù)據(jù)及系統(tǒng)發(fā)育分析

新獲取1條序列(GenBank登錄號OK037567)，比對后序列長度580 bp，變異位點(diǎn)57個和簡約信息位點(diǎn)23個，系統(tǒng)發(fā)育的結(jié)果顯示，BI和ML樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本相同。在文山馬關(guān)縣采集的蛙屬物種樣本與越南林同省的越南趾溝蛙樣本聚成單系(圖4)，支持率高(100%)。基于p-distance雙參數(shù)模型估算的新采集樣本與越南趾溝蛙的遺傳距離為0.8%。

3 討論

在云南文山州古林箐省級自然保護(hù)區(qū)采集到的越南趾溝蛙標(biāo)本與越南郎邊高原的該蛙模式標(biāo)本在外部形態(tài)描述上基本一致，同時系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果顯示，采集的標(biāo)本與模式標(biāo)本聚為一個支系，遺傳距離非常小(0.8%)?；谝陨辖Y(jié)果，證實(shí)了越南趾溝蛙在云南省文山州馬關(guān)縣的分布。本研究采集到的雄性標(biāo)本頭體長較模式標(biāo)本小(頭體長分別是38.3 mm和49.0 mm)[2]，且背部體色和腹部體色較深。越南趾溝蛙在云南馬關(guān)縣古林箐自然保護(hù)區(qū)的發(fā)現(xiàn)，提示與相鄰的廣西、越南地區(qū)有相似的物種組成，對動物地理學(xué)研究有重要意義。越南趾溝蛙的繁殖季節(jié)在8月下旬—9月下旬[3-4]，研究人員于2019年7月29日在古林箐保護(hù)區(qū)采集標(biāo)本時，未發(fā)現(xiàn)其抱對現(xiàn)象，由于考察時間較短，不確定該蛙是否進(jìn)入繁殖期，繁殖生活史需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝西南林業(yè)大學(xué)魏平凡和密歇根州立大學(xué)張寅鵬同學(xué)在文章撰寫過程中給予的幫助。